神經(jīng)機械性損傷中腦紅蛋白表達及作用的研究.pdf

1、氧是生命活動的基本物質(zhì)之一，而氧的代謝和利用一直是生命科學(xué)研究中的活躍領(lǐng)域。眾所周知，人體內(nèi)存在兩種與氧密切相關(guān)的球蛋白：血紅蛋白(hemoglobin，HGB)和肌紅蛋白(myoglobin，MGB)。它們是機體實現(xiàn)氧的儲存、利用、轉(zhuǎn)運、線粒體有氧活動及活性氧的清除等過程中的重要載體。成人腦雖然僅占體重的2％，但其有氧代謝非?；钴S，耗氧量占人體總耗氧量的20％左右。那么神經(jīng)系統(tǒng)中是否存在一種特異性的攜氧蛋白以促進腑的氧和能量代謝呢?這

2、一問題激起了科研工作者的廣泛興趣。2000年Burmester[1]等首次報道，脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在第三種單體攜氧珠蛋白--腑紅蛋白(neuroglobin，NGB)，它在皮層神經(jīng)元及視網(wǎng)膜中呈高表達，提示其可能參予了神經(jīng)系統(tǒng)氧與能量的代謝活動，為神經(jīng)系統(tǒng)氧利用的研究帶來新的曙光。已有的研究結(jié)果顯示[2-6]：缺氧可以誘導(dǎo)NGB表達上調(diào)，同時，高表達NGB有助于神經(jīng)組織耐受缺氧損傷，而抑制NGB農(nóng)達則會加重其損傷程度。以上研究為NGB

3、作為內(nèi)源性神經(jīng)保護因子提供了論據(jù)，為治療缺氧性神經(jīng)損傷提供了新思路。 在神經(jīng)外科的臨床工作中，顱腦創(chuàng)傷是最常見的病種之一。創(chuàng)傷后腦組織水腫，對氧的攝取和利用明顯下降是引起腦損傷的重要因素。而NGB作為神經(jīng)系統(tǒng)特有的攜氧球蛋白，研究其在神經(jīng)系統(tǒng)機械性損傷中的表達和作用，將為臨床工作中對顱腦創(chuàng)傷的診斷、治療提供新的契機和切入點。本研究包括： 1、建立體外培養(yǎng)原代神經(jīng)元機械性損傷模型：手術(shù)取胎鼠大腦皮層，分離純化后作原代神經(jīng)元

4、培養(yǎng)：用抗神元特異性蛋白--神經(jīng)絲蛋白(Neurofilament protein，NF)抗體鑒定細胞純度；對Banker體外損傷模型進行改良，采用自行設(shè)計的模版對培養(yǎng)神經(jīng)元進行機械性損傷，并在損傷后行光鏡下觀察及免疫組化檢測c-Fos蛋白來證實神經(jīng)元的損傷。 2、分別采用免疫組織化學(xué)、Western Blot技術(shù)檢測神經(jīng)元損傷后NGB的表達變化：神經(jīng)元NGB染色采用鏈霉素抗生物素-過氧化物酶連接法(SP法)，并采用圖像分析技術(shù)

5、(Image J軟件，美國國立衛(wèi)生院-NIH)觀測損傷前、后不同時間點神經(jīng)元的NGB免疫組化反應(yīng)陽性信號的灰度值：細胞裂解提取蛋白后，采用Western Blot技術(shù)檢測神經(jīng)元損傷前、后各時間點NGB的表達。兩種檢測方法的結(jié)果一致。 3、增加NGB的表達對損傷神經(jīng)源性細胞活性的影響：因神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染率低，因而采用轉(zhuǎn)染率高的神經(jīng)源性細胞(B104細胞)進行實驗。先按照損傷模型對B104細胞進行機械性損傷，采用Western Blot

6、技術(shù)檢測B104細胞損傷后NGB的表達變化．確定其變化趨勢與原代神經(jīng)元相同；然后采用軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院二所十三室制備的pCMV-Myc-NGB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染B104細胞，用Western Blot檢測技術(shù)驗證B104細胞轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-NGB質(zhì)粒后NGB表達增多；選取損傷后0.5h、2h兩個時間點，分別測定并比較未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及pCMV-Myc-NGB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的乳酸脫氫酶(LDH)活性及MTT細胞活性，證明了高表達NGB對機械性損

7、傷后的神經(jīng)源細胞具有保護作用。 4、大鼠急性局灶性腦損傷分級模型的建立：改進Feeney s自由落體模型裝置并制作大鼠急性局灶性腦損傷模型，以不同沖擊力(200gcm、600gcm、1000gcm)致大鼠腦損傷，鼠腦切片后并用TTC染色，采用Image J軟件計算各組損傷后壞死腦組織的體積，經(jīng)比較存在組間差異 5、大鼠急性局灶性顱腦損傷后血清NGB的水平變化：自行制備NGB雙抗夾心ELISA檢測試劑盒；測定傷后輕、中、重

8、各組腦損傷血清中的NGB含量并比較差異，證明了血清中NGB水平腦損傷程度呈正相關(guān)；測定同一損傷程度下，損傷后各時間點血清NGB的水平，顯示了損傷后血清中NGB水平的變化趨勢。 綜上所述，通過體外實驗，本研究證實單純的機械性損傷可以刺激神經(jīng)元腦紅蛋白表達上調(diào)，在機械性神經(jīng)損傷中，腦紅蛋白具有神經(jīng)細胞保護功能，為基于此保護機制研發(fā)新的神經(jīng)保護藥物用于腦損傷的治療提供了依據(jù)；通過在體實驗，初步證明腦損傷后血清NGB水平與損傷程度的關(guān)系