腦損傷后腦脂結(jié)合蛋白表達(dá)及作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 TBI后皮質(zhì)損傷區(qū)BLBP表達(dá)變化及其對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響
　　目的：
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域腦脂結(jié)合蛋白（brain lipid binding protein，BLBP）的表達(dá)變化及其對(duì)體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6增殖、遷移能力及侵襲性的影響。
　　方法：
　　1．SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照（Control）組和TBI組；<

2、br>　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)BLBP、GFAP表達(dá)情況并計(jì)數(shù)BLBP+/GFAP+細(xì)胞；
　　3．提取TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠損傷區(qū)周?chē)X皮質(zhì)總蛋白，Western blot檢測(cè)BLBP蛋白表達(dá)；
　　4．體外培養(yǎng)C6細(xì)胞，分為L(zhǎng)V-BLBP和LV-NC兩組，取最佳MOI時(shí)C6細(xì)胞總蛋白和總RNA，Western blot和r

3、eal-time PCR檢測(cè)C6細(xì)胞病毒感染后BLBP蛋白和mRNA表達(dá)；
　　5．EdU標(biāo)記S期C6細(xì)胞，免疫熒光技術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)C6細(xì)胞增殖水平；
　　6．CCK-8檢測(cè)培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h和120h C6細(xì)胞活力；
　　7．兩組細(xì)胞在10％FBS培養(yǎng)條件和1%FB的培養(yǎng)條件培養(yǎng)3d，提取總蛋白Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p16、p21、p27的表達(dá)；
　　8．劃痕實(shí)驗(yàn)

4、和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C6細(xì)胞遷移能力及侵襲性。
　　結(jié)果：
　　1．傷后1d、3d、7d、14d、21d和28d損傷區(qū)皮質(zhì)均能觀察到BLBP+/GFAP+的細(xì)胞，傷后7d細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰而后逐漸下降，28 d時(shí)僅能在損傷區(qū)皮質(zhì)邊緣觀察到少量BLBP+/GFAP+細(xì)胞。對(duì)照組大鼠皮質(zhì)偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。
　　2．TBI后損傷腦區(qū)BLBP蛋白表達(dá)：TBI后損傷區(qū)周?chē)べ|(zhì)BLBP表達(dá)量明顯上升，7d時(shí)達(dá)到高峰，隨后緩慢下降

5、，至28d依然高于正常組。
　　3．Western blot結(jié)果顯示感染BLBP過(guò)表達(dá)重組慢病毒后C6細(xì)胞顯著表達(dá)BLBP蛋白，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可見(jiàn)感染BLBP之后C6細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)錄BLBP mRNA。
　　4．免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)EdU標(biāo)記增殖態(tài)C6細(xì)胞，結(jié)果顯示10%FBS培養(yǎng)條件感染BLBP后細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞更多，與空病毒組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。改變培養(yǎng)條件至1%FBS培養(yǎng)基依然可見(jiàn)BLBP感染組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比

6、例明顯較空病毒組高。
　　5．CCK-8檢測(cè)C6細(xì)胞活力：10%FBS培養(yǎng)條件下與空病毒組比較BLBP感染后C6細(xì)胞在24h、48h、72h和96h細(xì)胞活力高于空病毒組。1%FBS培養(yǎng)條件BLBP感染組C6細(xì)胞在72h、96h和120h細(xì)胞活力高于空病毒組。
　　6．Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p16、p21、p27表達(dá)：蛋白條帶顯示在10%FBS培養(yǎng)條件下BLBP感染組和空病毒組p16無(wú)明顯差異，而在1%F

7、BS培養(yǎng)條件下BLBP感染組p16蛋白表達(dá)明顯下降，與空病毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；p21蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示不管在10%FBS培養(yǎng)條件還是在1%FBS培養(yǎng)條件下BLBP均能有效降低其表達(dá)，組間比較差異明顯；p27蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示在兩種培養(yǎng)條件下BLBP的表達(dá)與否均未能明顯影響其表達(dá)。
　　7．劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)C6細(xì)胞遷移情況未見(jiàn)BLBP過(guò)表達(dá)和空病毒感染組C6細(xì)胞遷移能力有明顯差異。
　　第二部分體外培養(yǎng)

8、C6細(xì)胞過(guò)表達(dá)BLBP基因芯片檢測(cè)與分析
　　目的：
　　為探討C6細(xì)胞過(guò)表達(dá)BLBP對(duì)相關(guān)下游基因表達(dá)影響，并分析、篩選感興趣的靶基因。
　　方法：
　　1．體外培養(yǎng)C6細(xì)胞，分為L(zhǎng)V-BLBP和LV-NC兩組；
　　2．基因芯片檢測(cè)、分析；
　　3．提取培養(yǎng)C6細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測(cè)C6細(xì)胞病毒感染后TGF-β2蛋白表達(dá)。
　　1．基因芯片檢測(cè)結(jié)果：以差異表達(dá)基因探針信號(hào)差

9、異篩選出的264基因探針進(jìn)入分析，過(guò)表達(dá)BLBP后相對(duì)于空病毒感染C6細(xì)胞有284個(gè)基因上調(diào)和250個(gè)基因下調(diào)。與神經(jīng)細(xì)胞有關(guān)的基因中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor2，TGF-β2）編碼基因在BLBP過(guò)表達(dá)后明顯上調(diào)。
　　2．Western blot檢測(cè)C6細(xì)胞TGF-β2蛋白表達(dá)：蛋白電泳結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)BLBP后C6細(xì)胞TGF-β2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與空病毒組細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

10、>　　第三部分 TGF-β2對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的：
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β2，TGF-β2）的表達(dá)變化及其對(duì)體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞株HA1800增殖和遷移能力的影響。
　　方法：
　　1．SD大鼠TBI模型制備，分為對(duì)照組和TBI組；
　　2

11、．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)TGF-β2、GFAP表達(dá)情況并計(jì)數(shù)；
　　3．取TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠損傷區(qū)周?chē)X皮質(zhì)，提取總蛋白Western blot檢測(cè)TGF-β2蛋白表達(dá)；
　　4．體外培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細(xì)胞株HA1800細(xì)胞，分別給予0ng/mL、2ng/mL和10ng/mL外源性TGF-β2因子。3d后EdU標(biāo)記S期HA1800細(xì)

12、胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)；
　　5．培養(yǎng)基中添加TGF-β2終濃度為0ng/mL、2ng/mL和10ng/mL，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HA1800細(xì)胞周期，計(jì)數(shù)各期細(xì)胞占總細(xì)胞百分比，了解細(xì)胞周期狀態(tài)；
　　6.劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同濃度外源性TGF-β2對(duì)HA1800細(xì)胞遷移能力的影響。
　　結(jié)果：
　　1．免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示傷后1d、3d、7d、14d、21d和28d損傷區(qū)皮質(zhì)均能觀察到TGF-β2+/GFAP+的細(xì)胞。傷后

13、7d達(dá)到高峰而后逐漸下降，28 d時(shí)依然能在損傷區(qū)皮質(zhì)邊緣觀察到較多的TGF-β2+/GFAP+細(xì)胞。對(duì)照組大鼠皮質(zhì)未見(jiàn)TGF-β2+陽(yáng)性細(xì)胞。
　　2．Western blot結(jié)果顯示TBI后TGF-β2表達(dá)量明顯上升，7d時(shí)達(dá)到高峰，隨后緩慢下降，至28d表達(dá)依然高于正常組。
　　3．隨外源性TGF-β2濃度的增加EdU陽(yáng)性標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。
　　4．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示外源性TGF-β2進(jìn)入培養(yǎng)基后，HA

14、1800細(xì)胞周期發(fā)生明顯變化。隨著TGF-β2在培養(yǎng)基中終濃度的上升，處于G2/M期的HA1800細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，變化趨勢(shì)與S期細(xì)胞類(lèi)似，10ng/mL組最多；反之G1期細(xì)胞數(shù)量則呈下降趨勢(shì)。
　　5．劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度外源性TGF-β2干預(yù)后細(xì)胞均能向中央空白處遷移，尤以3h和6h時(shí)明顯，至20h時(shí)空白處兩側(cè)的細(xì)胞已完全遷移進(jìn)入并相互接觸，組間比較以10ng/mL組細(xì)胞遷移效果最佳。
　　第四部分 TBI后皮質(zhì)損

15、傷區(qū)TGF-β1的表達(dá)及其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用
　　目的：
　　探討成年大鼠創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）后大腦皮質(zhì)損傷區(qū)域轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的表達(dá)變化及其對(duì)體外培養(yǎng)大鼠NSCs分化的影響。
　　方法：
　　1．制備SD大鼠TBI模型；
　　2．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d應(yīng)用免

16、疫熒光法檢測(cè)大鼠損傷區(qū)皮質(zhì)TGF-β1、IBA-1、GFAP表達(dá)情況；
　　3．Western blot和Elisa檢測(cè)TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d SD大鼠損傷區(qū)周?chē)X皮質(zhì)TGF-β1表達(dá)變化；
　　4．培養(yǎng)SD大鼠來(lái)源NSCs，分NSCs組、TGF-β1組、NSCs+Smad2 RNAi組和TGF-β1+Smad2 RNAi組，免疫熒光染色檢測(cè)NSCs分化為Map-2陽(yáng)性和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞情況。

17、>　　結(jié)果：
　　1．TBI后1d、3d、7d、14d、21d和28d損傷區(qū)皮質(zhì)均能觀察到GFAP+/TGF-β1+和IBA1+/TGF-β1+的細(xì)胞。損傷區(qū)皮質(zhì)GFAP+/TGF-β1+細(xì)胞數(shù)量逐漸上升，傷后7d達(dá)到高峰而后逐漸下降，28 d時(shí)僅能在損傷區(qū)皮質(zhì)邊緣觀察到少量TGF-β1+/GFAP+細(xì)胞。IBA1+細(xì)胞在損傷后一天即有表達(dá)，隨時(shí)間點(diǎn)的延長(zhǎng)IBA1+/TGF-β1+雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量快速上升，3d后上升速度放緩至14

18、d達(dá)到高峰而后逐漸下降，28d時(shí)損傷區(qū)周?chē)家?jiàn)IBA1+/TGF-β1+陽(yáng)性細(xì)胞。
　　2．Western blot和Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示，TBI后TGF-β1表達(dá)量明顯上升，3d時(shí)達(dá)到高峰，隨后緩慢下降，14d后形成平臺(tái)期。
　　3．體外培養(yǎng)NSCs給予不同濃度外源性TGF-β1因子干預(yù)，結(jié)果顯示不同時(shí)間點(diǎn)均能見(jiàn)到GFAP+細(xì)胞數(shù)量變化，3d時(shí)間點(diǎn)2ng/mL TGF-β1干預(yù)后NSCs分化為GFAP+細(xì)胞較0ng/mL

19、組明顯增多，隨著TGF-β1濃度的提高GFAP+細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)增多，反而有所減少，但與0ng/mL組比較差異依然明顯。7d時(shí)間點(diǎn)GFAP+細(xì)胞表現(xiàn)的趨勢(shì)與3d時(shí)間點(diǎn)類(lèi)似。
　　4．MAP-2、GFAP免疫熒光檢測(cè)Smad2 RNAi后NSCs分化情況：培養(yǎng)14d結(jié)果顯示加入2ng/mL的TGF-β1后MAP2陽(yáng)性細(xì)胞分化比例較正常NSCs分化比例下降明顯。TGF-β1+Smad2 RNAi組MAP-2陽(yáng)性細(xì)胞的比例較TGF-β1組有所

20、增加，但未能達(dá)到正常培養(yǎng)組或NSCs+Smad2 RNAi組水平。
　　結(jié)論：
　　1．大鼠TBI后，損傷區(qū)皮質(zhì)BLBP、TGF-β1/2表達(dá)上調(diào)，并能與GFAP共標(biāo)；
　　2．過(guò)表達(dá)BLBP能夠通過(guò)下調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白p21、p16的方式來(lái)重置細(xì)胞周期并促進(jìn)C6細(xì)胞增殖，但對(duì)C6細(xì)胞的遷移能力和侵襲性無(wú)影響；
　　3．C6細(xì)胞過(guò)表達(dá)BLBP后能夠上調(diào)TGF-β2的表達(dá)水平；
　　4．TGF-β2表達(dá)上調(diào)能