硫酸軟骨素減輕實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞損傷機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分三部分研究了硫酸軟骨素減輕實(shí)驗(yàn)性急性壞死性胰腺炎胰腺腺泡細(xì)胞損傷機(jī)制： 論文一：硫酸軟骨素腹腔注射預(yù)處理對(duì)大鼠急性壞死性胰腺炎胰腺細(xì)胞的保護(hù)作用 研究方法：雄性Wistar大鼠(n=90)。隨機(jī)分為3組：A組，急性壞死性胰腺炎組；B組，硫酸軟骨素處理組；C組，假手術(shù)組，僅翻動(dòng)胰腺。動(dòng)物模型采用Aho等的方法。腹腔注射10％水合氯醛麻醉動(dòng)物后剖腹，在手術(shù)顯微鏡下進(jìn)行?；悄懰徕c膽胰管逆行注射。B組動(dòng)物在ANP誘導(dǎo)前1

2、h，腹腔注射硫酸軟骨素(30mg/kg)，A、C組以等量鹽水代替。各組動(dòng)物分別在30、、1、3、6、12h處死，取腹主動(dòng)脈血測(cè)定SAM。切取12指腸窗內(nèi)胰腺組織測(cè)定MDA、GSH、SOD和ATP含量。在胰尾部組織中迅速切取1mm<'3>小塊固定于2％戊二醛固定液中送電鏡檢查。其余部分以中性甲醛固定做：HE染色進(jìn)行病理評(píng)分。以TAB比色法測(cè)定MDA；以亞硝酸鹽形成法測(cè)定SOD；以Beutler改良法測(cè)定GSH；用色譜法測(cè)定ATP含量。觀察

3、胰腺組織的病理學(xué)變化(包括大體組織形態(tài)、光鏡及電鏡下的病理變化)。 研究結(jié)果： A、B兩組均有SAM水平的升高，病理組織學(xué)上有相應(yīng)的ANP變化。同一時(shí)點(diǎn)比較發(fā)現(xiàn)：A組胰腺組織中GSH、SOD、ATP明顯下降(P<0.05)、MDA明顯升高(P<0.05)；B組則GSH、SOD、ATP下降幅度較小，與A組比較差異有顯著性(P<0.05)，MDA升高幅度小，與A組比較差異有顯著性(P<0.05)。 研究結(jié)論：

4、 ANP時(shí)胰腺組織中內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)顯著下降，脂質(zhì)過(guò)氧化增加。有明顯的氧化應(yīng)激損傷，硫酸軟骨素腹腔注射預(yù)處理可作為氧自由基清除劑明顯減輕．ANP大鼠胰腺細(xì)胞損傷。 論文二：硫酸軟骨素腹腔注射對(duì)ANP大鼠胰腺細(xì)胞間連接和F-actin細(xì)胞骨架的穩(wěn)定作用 研究方法：雄性Wistar大鼠(n=90)，隨機(jī)分三組：A組為急性壞死性胰腺炎模型組(ANP)(5％?；悄懰徕c逆行胰管注射)；B組為硫酸軟骨素處理組；C組為假手術(shù)組。三組動(dòng)

5、物分別于30、1h、3h、6h、12h處死。檢測(cè)胰腺系數(shù)(胰濕重/鼠體重×100％)；透射電鏡觀察細(xì)胞間連接的變化；在激光共聚焦顯微鏡下觀察粘合連接蛋白-E-鈣粘素(E-cadherin)在細(xì)胞內(nèi)分布、定位的變化；western-blot進(jìn)行E-cadherin蛋白半定量檢測(cè)及RT-PCR．顯示其mRNA的變化趨勢(shì)。以羅丹明一法羅丁進(jìn)行F-actin染色，在共聚焦激光顯微鏡下觀察并采集圖象、熒光值分析。胰腺的HSP27組化染色，應(yīng)用HS

6、P27和HSP27磷酸化抗體進(jìn)行western-blotting半定量分析HSP27蛋白及其磷酸化蛋白的含量。應(yīng)用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表達(dá)。 研究結(jié)果： A組胰腺系數(shù)迅速升高并持續(xù)增長(zhǎng)，間質(zhì)水腫嚴(yán)重(P<0.05)，細(xì)胞間連接損傷，E-cadherin彌漫分布于胞漿內(nèi)，western-blot及RT-PCR結(jié)果顯示E-cadherin蛋白含量持續(xù)下降(P<0.05)而其mRNA水平明顯升高(P<

7、0.05)；在B組中發(fā)現(xiàn)間質(zhì)水腫比A組差(P<0.05)，細(xì)胞連接穩(wěn)定，雖E-cadherin在細(xì)胞內(nèi)分布、定位紊亂，但其蛋白水平明顯高于A組(P<0.05)，而mRNA水平與A組無(wú)明顯差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)性急性胰腺炎早期就存在細(xì)胞骨架的急劇變化和F-actin含量降低。硫酸軟骨素引起了HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表達(dá)水平升高，緩解了actin細(xì)胞骨架的損傷。 研究結(jié)論： 在?；悄懰徕c誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)

8、性ANP早期，存在細(xì)胞粘合蛋白-E-cadherin的降解，胰腺細(xì)胞連接解體從而引起胰腺水腫，以及細(xì)胞骨架的劇烈變化，F(xiàn)-actin分布紊亂、含量降低。同時(shí)伴隨有HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白、mRNA表達(dá)升高。HSP27在結(jié)構(gòu)較好的腺泡細(xì)胞中高表達(dá)說(shuō)明，HSP27可能具有保護(hù)作用。硫酸軟骨素(CS)作為氨基葡聚糖家族(GAGs)主要成員之一，通過(guò)緩解穩(wěn)定了細(xì)胞連接從而減輕了胰腺水腫。同時(shí)，硫酸軟骨素增高了}tSP27的應(yīng)激表達(dá)緩

9、解了細(xì)胞骨架損傷。硫酸軟骨素引起的HSP27表達(dá)升高可能源于它的細(xì)胞保護(hù)作用從而減少了蛋白損傷。另外，基因表達(dá)增高也可能參與了這一作用。 論文三：硫酸軟骨素增加HSP27蛋白及其磷酸化表達(dá)減輕離體胰腺細(xì)胞骨架損傷的機(jī)制 研究方法：細(xì)胞提純時(shí)采用了一種改良的方法，取健康的雄性Wistar大鼠10只，體重200-250克，以乙醚吸入方法麻醉動(dòng)物后浸于75％乙醇中消毒。無(wú)菌條件下，于超凈工作臺(tái)上，在手術(shù)顯微鏡下，經(jīng)膽胰管匯合處

10、穿刺緩慢逆行注入細(xì)胞分離液(2mg/mL濃度的Ⅰ型膠原酶，3-5mL)，然后迅速切取胰腺，將胰腺組織剪碎為約1-3mm<'3>小塊后，加入預(yù)熱的細(xì)胞分離液，在37℃水浴箱中攪動(dòng)120rpm消化10分鐘。經(jīng)過(guò)過(guò)濾、離心，提取胰腺腺泡細(xì)胞的單細(xì)胞懸液并收集細(xì)胞放于CO<,2>孵箱內(nèi)(37℃，5％CO<,2>)。細(xì)胞計(jì)數(shù)：吸取少量細(xì)胞懸液，加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在倒置顯微鏡下(10×物鏡)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞活性測(cè)定(臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn))：計(jì)數(shù)活細(xì)胞和

11、死細(xì)胞數(shù)目，計(jì)算細(xì)胞活性率。腺泡細(xì)胞純化率鑒定：將細(xì)胞懸液調(diào)整到10<'5>-10<'6>個(gè)/mL濃度后，在離心涂片儀上進(jìn)行細(xì)胞離心涂片(1000rpm，10分鐘)制成細(xì)胞切片，分別給予HE染色和酶原顆粒的亞甲藍(lán)特殊染色，計(jì)算出腺泡細(xì)胞純化率。 細(xì)胞分離后隨機(jī)分為三組：ANP組(A組)；ANP+硫酸軟骨素組(B組)；對(duì)照組(C組)。在B組中細(xì)胞懸液與4％的硫酸軟骨素預(yù)孵30分鐘后，以0.2％牛磺膽酸鈉分別處理30分鐘、1小時(shí)、3

12、小時(shí)。但A組和C組僅給予等量生理鹽水預(yù)孵，并且在C組中僅給予等量生理鹽水代替牛磺膽酸鈉進(jìn)行細(xì)胞處理。以羅丹明一法羅丁進(jìn)行F-actin染色，在共聚焦激光顯微鏡下觀察并采集圖象，以流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞F-actin含量測(cè)定。應(yīng)用HSP27和HSP27磷酸化蛋白(Ser15、86)抗體進(jìn)行western-blotting半定量分析HSP27和HSP27磷酸化蛋白含量。應(yīng)用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表達(dá)。 研究結(jié)果：

13、在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)目，按公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)目=(4大格細(xì)胞數(shù)之和/4)×10<'4>×細(xì)胞原液量(mL)得出平均每只大鼠可提取細(xì)胞數(shù)目為4.7±0.6×10<'6>個(gè)細(xì)胞與文獻(xiàn)報(bào)道無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞活性率：臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)，藍(lán)染者為死細(xì)胞，計(jì)算活細(xì)胞率為91±7％，符合文獻(xiàn)報(bào)道。腺泡細(xì)胞純化率：分別計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野的HE切片上的細(xì)胞數(shù)和亞甲藍(lán)特殊染色切片上的細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出腺泡細(xì)胞純化率。不同文獻(xiàn)報(bào)道的腺泡細(xì)胞純化率從40-60％到8

14、0-90％差異較大，本實(shí)驗(yàn)中得到的腺泡細(xì)胞純化率為70-80％。 ?；悄懰徕c處理離體胰腺細(xì)胞后，早期就存在細(xì)胞骨架的急劇變化和F-actin含量降低。硫酸軟骨素緩解了actin細(xì)胞骨架的損傷，引起了HSP27、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表達(dá)水平升高。 研究結(jié)論： 本實(shí)驗(yàn)中的改良方法具有耗酶量少、技術(shù)難度小的特點(diǎn)，是一種簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離、純化的方法?？梢灾苯又苽鋯渭?xì)胞懸液，更加便于施加處理因素