硫酸軟骨素減輕實驗性急性壞死性胰腺炎胰腺腺泡細胞損傷機制的研究.pdf

1、本研究分三部分研究了硫酸軟骨素減輕實驗性急性壞死性胰腺炎胰腺腺泡細胞損傷機制： 論文一：硫酸軟骨素腹腔注射預處理對大鼠急性壞死性胰腺炎胰腺細胞的保護作用 研究方法：雄性Wistar大鼠(n=90)。隨機分為3組：A組，急性壞死性胰腺炎組；B組，硫酸軟骨素處理組；C組，假手術組，僅翻動胰腺。動物模型采用Aho等的方法。腹腔注射10％水合氯醛麻醉動物后剖腹，在手術顯微鏡下進行?；悄懰徕c膽胰管逆行注射。B組動物在ANP誘導前1

2、h，腹腔注射硫酸軟骨素(30mg/kg)，A、C組以等量鹽水代替。各組動物分別在30、、1、3、6、12h處死，取腹主動脈血測定SAM。切取12指腸窗內胰腺組織測定MDA、GSH、SOD和ATP含量。在胰尾部組織中迅速切取1mm<'3>小塊固定于2％戊二醛固定液中送電鏡檢查。其余部分以中性甲醛固定做：HE染色進行病理評分。以TAB比色法測定MDA；以亞硝酸鹽形成法測定SOD；以Beutler改良法測定GSH；用色譜法測定ATP含量。觀察

3、胰腺組織的病理學變化(包括大體組織形態(tài)、光鏡及電鏡下的病理變化)。 研究結果： A、B兩組均有SAM水平的升高，病理組織學上有相應的ANP變化。同一時點比較發(fā)現(xiàn)：A組胰腺組織中GSH、SOD、ATP明顯下降(P<0.05)、MDA明顯升高(P<0.05)；B組則GSH、SOD、ATP下降幅度較小，與A組比較差異有顯著性(P<0.05)，MDA升高幅度小，與A組比較差異有顯著性(P<0.05)。 研究結論：

4、 ANP時胰腺組織中內源性抗氧化物質顯著下降，脂質過氧化增加。有明顯的氧化應激損傷，硫酸軟骨素腹腔注射預處理可作為氧自由基清除劑明顯減輕．ANP大鼠胰腺細胞損傷。 論文二：硫酸軟骨素腹腔注射對ANP大鼠胰腺細胞間連接和F-actin細胞骨架的穩(wěn)定作用 研究方法：雄性Wistar大鼠(n=90)，隨機分三組：A組為急性壞死性胰腺炎模型組(ANP)(5％?；悄懰徕c逆行胰管注射)；B組為硫酸軟骨素處理組；C組為假手術組。三組動

5、物分別于30、1h、3h、6h、12h處死。檢測胰腺系數(shù)(胰濕重/鼠體重×100％)；透射電鏡觀察細胞間連接的變化；在激光共聚焦顯微鏡下觀察粘合連接蛋白-E-鈣粘素(E-cadherin)在細胞內分布、定位的變化；western-blot進行E-cadherin蛋白半定量檢測及RT-PCR．顯示其mRNA的變化趨勢。以羅丹明一法羅丁進行F-actin染色，在共聚焦激光顯微鏡下觀察并采集圖象、熒光值分析。胰腺的HSP27組化染色，應用HS

6、P27和HSP27磷酸化抗體進行western-blotting半定量分析HSP27蛋白及其磷酸化蛋白的含量。應用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表達。 研究結果： A組胰腺系數(shù)迅速升高并持續(xù)增長，間質水腫嚴重(P<0.05)，細胞間連接損傷，E-cadherin彌漫分布于胞漿內，western-blot及RT-PCR結果顯示E-cadherin蛋白含量持續(xù)下降(P<0.05)而其mRNA水平明顯升高(P<

7、0.05)；在B組中發(fā)現(xiàn)間質水腫比A組差(P<0.05)，細胞連接穩(wěn)定，雖E-cadherin在細胞內分布、定位紊亂，但其蛋白水平明顯高于A組(P<0.05)，而mRNA水平與A組無明顯差異(P>0.05)。實驗性急性胰腺炎早期就存在細胞骨架的急劇變化和F-actin含量降低。硫酸軟骨素引起了HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表達水平升高，緩解了actin細胞骨架的損傷。 研究結論： 在?；悄懰徕c誘導的實驗

8、性ANP早期，存在細胞粘合蛋白-E-cadherin的降解，胰腺細胞連接解體從而引起胰腺水腫，以及細胞骨架的劇烈變化，F(xiàn)-actin分布紊亂、含量降低。同時伴隨有HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白、mRNA表達升高。HSP27在結構較好的腺泡細胞中高表達說明，HSP27可能具有保護作用。硫酸軟骨素(CS)作為氨基葡聚糖家族(GAGs)主要成員之一，通過緩解穩(wěn)定了細胞連接從而減輕了胰腺水腫。同時，硫酸軟骨素增高了}tSP27的應激表達緩

9、解了細胞骨架損傷。硫酸軟骨素引起的HSP27表達升高可能源于它的細胞保護作用從而減少了蛋白損傷。另外，基因表達增高也可能參與了這一作用。 論文三：硫酸軟骨素增加HSP27蛋白及其磷酸化表達減輕離體胰腺細胞骨架損傷的機制 研究方法：細胞提純時采用了一種改良的方法，取健康的雄性Wistar大鼠10只，體重200-250克，以乙醚吸入方法麻醉動物后浸于75％乙醇中消毒。無菌條件下，于超凈工作臺上，在手術顯微鏡下，經膽胰管匯合處

10、穿刺緩慢逆行注入細胞分離液(2mg/mL濃度的Ⅰ型膠原酶，3-5mL)，然后迅速切取胰腺，將胰腺組織剪碎為約1-3mm<'3>小塊后，加入預熱的細胞分離液，在37℃水浴箱中攪動120rpm消化10分鐘。經過過濾、離心，提取胰腺腺泡細胞的單細胞懸液并收集細胞放于CO<,2>孵箱內(37℃，5％CO<,2>)。細胞計數(shù)：吸取少量細胞懸液，加到細胞計數(shù)板上，在倒置顯微鏡下(10×物鏡)計數(shù)細胞數(shù)目。細胞活性測定(臺盼藍排斥實驗)：計數(shù)活細胞和

11、死細胞數(shù)目，計算細胞活性率。腺泡細胞純化率鑒定：將細胞懸液調整到10<'5>-10<'6>個/mL濃度后，在離心涂片儀上進行細胞離心涂片(1000rpm，10分鐘)制成細胞切片，分別給予HE染色和酶原顆粒的亞甲藍特殊染色，計算出腺泡細胞純化率。 細胞分離后隨機分為三組：ANP組(A組)；ANP+硫酸軟骨素組(B組)；對照組(C組)。在B組中細胞懸液與4％的硫酸軟骨素預孵30分鐘后，以0.2％?；悄懰徕c分別處理30分鐘、1小時、3

12、小時。但A組和C組僅給予等量生理鹽水預孵，并且在C組中僅給予等量生理鹽水代替?；悄懰徕c進行細胞處理。以羅丹明一法羅丁進行F-actin染色，在共聚焦激光顯微鏡下觀察并采集圖象，以流式細胞儀進行細胞F-actin含量測定。應用HSP27和HSP27磷酸化蛋白(Ser15、86)抗體進行western-blotting半定量分析HSP27和HSP27磷酸化蛋白含量。應用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表達。 研究結果：

13、在倒置顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)目，按公式計算：細胞數(shù)目=(4大格細胞數(shù)之和/4)×10<'4>×細胞原液量(mL)得出平均每只大鼠可提取細胞數(shù)目為4.7±0.6×10<'6>個細胞與文獻報道無統(tǒng)計學差異。細胞活性率：臺盼藍排斥實驗，藍染者為死細胞，計算活細胞率為91±7％，符合文獻報道。腺泡細胞純化率：分別計數(shù)10個高倍視野的HE切片上的細胞數(shù)和亞甲藍特殊染色切片上的細胞數(shù)，計算出腺泡細胞純化率。不同文獻報道的腺泡細胞純化率從40-60％到8

14、0-90％差異較大，本實驗中得到的腺泡細胞純化率為70-80％。 ?；悄懰徕c處理離體胰腺細胞后，早期就存在細胞骨架的急劇變化和F-actin含量降低。硫酸軟骨素緩解了actin細胞骨架的損傷，引起了HSP27、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表達水平升高。 研究結論： 本實驗中的改良方法具有耗酶量少、技術難度小的特點，是一種簡易、經濟的大鼠胰腺腺泡細胞分離、純化的方法。可以直接制備單細胞懸液，更加便于施加處理因素