2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
已閱讀1頁,還剩115頁未讀, 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡(jiǎn)介

1、核因子κB(NF-κB)是細(xì)胞核內(nèi)一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子,在許多腫瘤細(xì)胞中均存在其異?;罨?。活化后的NF-κB,不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相關(guān)基因的表達(dá),更重要的是,它還可上調(diào)細(xì)胞凋亡抗性分子基因的表達(dá),從而使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞凋亡,成為腫瘤細(xì)胞生存的關(guān)鍵因素之一。由于在包括各種類型的急性髓系白血病(AML)原代細(xì)胞,白血病干細(xì)胞(LSC)以及白血病細(xì)胞株如HL-60細(xì)胞等在內(nèi)的多種類型的AML白血病細(xì)胞也存在持續(xù)活化的NF-κB。因此,

2、NF-κB的異?;罨徽J(rèn)為可能參與AML的發(fā)生與發(fā)展,這也意味著NF-κB很可能是靶向治療AML的一個(gè)潛在性靶分子。 NF-κB的活化受到多種因素的調(diào)控,其中,IκBα是NF-κB活化調(diào)控的一種主要抑制蛋白。通常情況下,IκBα與NF-κB結(jié)合而使后者以無活性的形式位于細(xì)胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后,IκBα分子第32位和第36位的絲氨酸被其激酶IKK復(fù)合物磷酸化,磷酸化后的IκBα又快速發(fā)生泛蛋白化。隨后,IκBα被蛋白酶體降解,

3、而NF-κB則與IκBα解離并曝露出其細(xì)胞核定位信號(hào),從而進(jìn)入細(xì)胞核,成為活化的NF-κB。很顯然,IκBα磷酸化和降解是NF-κB活化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟。因此,抑制IκBα的磷酸化和降解就有可能抑制NF-κB的活化,從而影響其生物學(xué)功能。例如,用各種突變型的IκBα(mIκBα)能夠抑制多種實(shí)體瘤細(xì)胞和白血病細(xì)胞NF-κB的活化并可引起細(xì)胞凋亡;用蛋白酶體抑制劑如MG-132可抑制AML患者LSC內(nèi)NF-κB的活化并引起細(xì)胞凋亡。然而,與

4、其它蛋白酶體抑制劑一樣,MG-132也并非為直接作用于NF-κB的特異性抑制物。而且,高濃度或較長(zhǎng)時(shí)間(24小時(shí)以上)的使用MG-132對(duì)正常CD34<'+>細(xì)胞還具有毒性作用。顯然,使用蛋白酶體抑制劑來抑制NF-κB的活化并非為最佳的方法。另外,盡管已有通過應(yīng)用mIκBα來抑制白血病細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化的研究報(bào)道。但是,在那些為數(shù)不多的幾個(gè)實(shí)驗(yàn)中,通常采用的都是以腺病毒(Ad)5為基礎(chǔ)構(gòu)建的Ad載體(AdVec)系統(tǒng)感染而轉(zhuǎn)移第32位

5、和第36位絲氨基酸被非磷酸化丙氨酸替代的mIκBα到靶細(xì)胞的方法。然而,有研究發(fā)現(xiàn),除了第32位和第36位絲氨酸外,IκBα分子其它部位氨基酸的磷酸化如第42位酪氨酸磷酸化也與NF-κB的活化有關(guān)。更重要的是,通過Ad5為基礎(chǔ)的AdVec系統(tǒng)感染轉(zhuǎn)移基因到造血早期細(xì)胞如造血干/祖細(xì)胞和白血病原始細(xì)胞可能比較困難。例如,有研究顯示,骨髓細(xì)胞以及一些惡性髓系細(xì)胞株對(duì)Ad5為基礎(chǔ)的Ad感染無反應(yīng)。因此,為克服這些不足之處,非常必要尋找其他的方

6、法。鑒于目前的研究現(xiàn)狀,本研究采用一種新型嵌合腺病毒載體系統(tǒng)即Ad5F35 AdVec系統(tǒng)感染的方法將缺失mIκBα cDNA轉(zhuǎn)移到HL-60細(xì)胞以探討該mIκBα對(duì)HL-60細(xì)胞凋亡和分化的影響及其作用的可能機(jī)制。 首先,通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù),本研究從高表達(dá)IκBα mRNA的鼻咽癌細(xì)胞株CNE2細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增編碼缺失了IκBα分子氨基端包括NF-κB活化所需要的磷酸化位點(diǎn)在內(nèi)的第1~第70個(gè)氨基酸序列的

7、mIκBα cDNA即IκBαDN cDNA。然后,經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化、電泳回收和體外連接并通過中間載體pCR-Script<'TM>SK,(+)將IκBαDN cDNA分別克隆到真核生物表達(dá)載體pcDNA3.1(+)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN以及腺病毒穿梭載體pDC316內(nèi)。結(jié)果顯示,通過RT-PCR技術(shù),從CNE2鼻咽癌細(xì)胞成功擴(kuò)增到IκBαDN cDNA并將其分別重組到pcDNA3.1(+)、pCLXSN和pDC316載體,

8、從而構(gòu)建到重組pcDNA-IκBαDN、pCLX-IκBαDN和pDC-IκBαDN載體。DNA序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),重組pcDNA-IκBαDN、pCLX-IκBαDN以及pDC-IκBαDN載體攜帶有未發(fā)生任何額外突變的IκBαDN cDNA并且其閱讀框架正確。 在構(gòu)建好上述含有IκBαDN cDNA各種重組載體后,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步制備了攜帶有IκBαDN cDNA的重組Ad5F35 AdVec系統(tǒng)即Ad5F35-IκBαDN

9、 Ad。為有效轉(zhuǎn)移IκBαDN cDNA進(jìn)入HL-60細(xì)胞,首先探討了重組Ad5F35 AdVec系統(tǒng)感染HL-60細(xì)胞的最佳條件。在此基礎(chǔ)上,將重組Ad5F35-IκBαDN AdVec系統(tǒng)感染HL-60細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù),NF-κBDNA結(jié)合活性實(shí)驗(yàn)、Western印跡和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別分析其對(duì) HL-60細(xì)胞凋亡和分化的影響以及轉(zhuǎn)染后HL-60細(xì)胞NF-κB活性,IκBα、細(xì)胞凋亡抑制蛋白-2(clAP-2)和X連鎖的凋亡

10、抑制蛋白(x-IAP)mRNA的表達(dá)。 結(jié)果顯示,重組Ad5F35-IκBαDN AdVec系統(tǒng)感染HL-60細(xì)胞48小時(shí)后,AnnexinV<'+>/PI。以及AnnexinV<'+>/PI<'+>細(xì)胞數(shù)為(22.53±2.999)%,而未轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞其AnnexinV<'+>/PI<'->以及AnnexinV<'+>/PI<'+>細(xì)胞數(shù)為(4.86±1.366)%,轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-EGFP AdVec的HL-6

11、0細(xì)胞其AnnexinV<'+>/PI<'->以及AnnexinV<'+>/PI<'+>細(xì)胞數(shù)平均為(6.08±2.464)%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)學(xué)分析,轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-IκBαDN AdVec的HL-60細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞以及與轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60細(xì)胞其AnnexinV<'+>/PI<'->和AnnexinV<'+>/PI<'+>細(xì)胞數(shù)具有顯著差異,P值分別是P<0.001和0.001

12、002。但是,未轉(zhuǎn)染的HL-60細(xì)胞與轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60細(xì)胞其AnnexinV<'+>/PI<'->以及AnnexinV<'+>/PI<'+>細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(0.2

13、合活性分析結(jié)果顯示,感染重組Ad5F35-IκBαDN AdVec系統(tǒng)的HL-60細(xì)胞平均NF-κB DNA結(jié)合活2性為0.14活性單位,而未轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-EGFP AdVec的HL-60細(xì)胞平均NF-κB DNA結(jié)合活性單位分別為0.43和0.35。Western印跡和實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示,感染了重組Ad5F35-IκBαDN AdVec系統(tǒng)的HL-60細(xì)胞IκBαDN的表達(dá)是增加的,其IκBα mRNA的表達(dá)水

14、平分別是未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-EGFPAd HL-60細(xì)胞的2.51和3.16倍。與此相反,轉(zhuǎn)染了重組Ad5F35-IκBαDNAdVec的HL-60細(xì)胞cIAP-2和xIAP mRNA的表達(dá)卻是降低的,其表達(dá)水平分別是未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染重組Ad5F35-EGFPAdVec HL-60細(xì)胞的0..49、0.48和0.42、0.45倍。這些結(jié)果表明,嵌合的Ad5F35 AdVec能夠有效介導(dǎo)IκBαDN cDNA在HL-60細(xì)胞高表達(dá),

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論