白藜蘆醇對白血病HL-60細(xì)胞增殖、自噬及自噬相關(guān)基因表達的影響.pdf

1、[目的]
　　 中藥白藜蘆醇(resveratrol,Res)主要來源于蓼科植物虎杖的根莖提取物,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Res具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、鎮(zhèn)咳平喘、降低血液粘稠度、改善微循環(huán)以及抗腫瘤等作用。近年來體內(nèi)外試驗研究均證實白藜蘆醇對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,是繼紫杉醇之后的又一新的綠色抗癌藥物。
　　 單丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)是一種特殊的熒光染料,可被細(xì)胞吸收并與自噬囊泡(aut

2、ophagic vacuoles Avs)特異結(jié)合,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)點狀綠色熒光,是一種定量檢查自噬的特異性方法。
　　 哺乳動物微管相關(guān)蛋白-輕鏈3(Microtubule-associated protein1 light chain3,MAP1LC3或稱LC3)最初是作為微管相關(guān)蛋白1(MAP1)的第三條輕鏈被發(fā)現(xiàn)的,是自噬相關(guān)基因Atg8在哺乳動物中的同源基因。
　　 本實驗應(yīng)用CCK-8試劑盒、MDC染色、流

3、式細(xì)胞術(shù)、熒光定量PCR技術(shù),研究Res對HL-60細(xì)胞的增殖、自噬的影響,為白藜蘆醇治療急性髓系白血病提供理論依據(jù)。
　　 [方法]
　　 (1)體外培養(yǎng)HL-60白血病細(xì)胞株,取對數(shù)生長期的細(xì)胞進行實驗研究。
　　 (2)CCK-8試劑盒檢測不同濃度的Res對HL-60細(xì)胞增值的影響。
　　 (3)倒置相差顯微鏡下觀察不同濃度的Res作用下HL-60細(xì)胞的形態(tài)。
　　 (4)MDC熒光染色檢測

4、Res作用于HL-60細(xì)胞后自噬現(xiàn)象的變化。
　　 (5)流式細(xì)胞儀分析測定自噬比率。
　　 (6)熒光定量PCR檢測不同濃度Res作用于HL-60細(xì)胞后自噬相關(guān)基因MAP1LC3A的mRNA的表達。
　　 [結(jié)果]
　　 (1)實驗結(jié)果顯示Res作用于HL-60細(xì)胞12h、24h、36h、48h的半數(shù)抑制率(IC50)分別為209.92±62.251μmol/L,85.67±20.05μmol/L,78

5、.89±16.12μmol/L,63.73±10.43μmol/L。隨著藥物濃度的增加、作用時間的延長,細(xì)胞抑制率明顯增加。抑制率呈現(xiàn)出劑量、時間效應(yīng)關(guān)系。
　　 (2)倒置相差顯微鏡觀察結(jié)果顯示隨著Res濃度的增加和作用時間的延長,活細(xì)胞數(shù)目越少,細(xì)胞透明度和亮度都降低,體積變小,而空白對照組的HL-60細(xì)胞呈增殖生長。
　　 (3)200μmol/L的Res作用于HL-60細(xì)胞24h后,經(jīng)MDC染色,置于熒光顯微鏡下

6、觀察,可見自噬囊泡的出現(xiàn),表明Res可能具有誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生自噬的作用。
　　 (4)流式細(xì)胞儀分析測定其自噬比率,200μmol/L的Res作用于HL-60細(xì)胞24h其自噬比率是25.55％,而陰性對照組是4.47%,實驗組與對照組比較明顯增高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 (5)Res作用于HL-60細(xì)胞24h后,隨著濃度的增加,自噬相關(guān)基因MAP1LC3AmRNA表達逐漸增多,各實驗組與對照組相