GAS6參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、第一部分急性冠脈綜合征患者血清中GAS6 水平及其基因多態(tài)性表達(dá)
　　 背景:生長(zhǎng)停滯特異性基因6（GAS6）編碼的維生素K 依賴性蛋白與其受體結(jié)合具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，參與調(diào)節(jié)炎癥、血管生成及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。已有研究發(fā)現(xiàn)GAS6表達(dá)水平與斑塊的穩(wěn)定性和中風(fēng)的發(fā)生相關(guān)。但是GAS6在冠心病發(fā)病機(jī)制中的作用如何尚不清楚。
　　 目的:通過檢測(cè)冠心病患者外周血中GAS6表達(dá)水平，以及對(duì)GAS6基因型的分析，探討GAS

2、6與冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，特別是在急性冠脈綜合征（ACS）中GAS6 發(fā)揮的作用。
　　 方法:通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)冠心病患者外周血清中GAS6的表達(dá)水平，并用單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析研究GAS6 c.834+7G>A基因型在ACS 患者中表達(dá)的意義。
　　 結(jié)果:檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，健康人群外周血清中GAS6 濃度平均值為16.9 μg/L （13-28 μg/L），而ACS 患者外周血清中GAS6 濃度則是10.65μ

3、g/L （5.7-27.5μg/L）。ACS 患者GAS6的基因表達(dá)為GG，AG和AA，其基因型頻率分別為66％，29％和5％，相比健康人群則分別是35％，45％和20％。GAS6的AA基因型和等位基因A在ACS 患者血清中表達(dá)低于健康對(duì)照。
　　 結(jié)論:研究表明入院時(shí)患者外周血清中GAS6 水平可以作生物學(xué)指標(biāo)，反映常見心血管危險(xiǎn)因素的存在，并預(yù)測(cè)心血管事件發(fā)生。ACS 患者GAS6基因型表達(dá)為GG，AG和AA，當(dāng)GAS6基因

4、表達(dá)以AA基因型和等位基因A 為主時(shí)，ACS 發(fā)病減少。GAS6與ACS的發(fā)病相關(guān)，可能對(duì)ACS 患者具有保護(hù)作用。
　　 第二部分 GAS6 對(duì)參與巨噬細(xì)胞膽固醇代謝關(guān)鍵基因表達(dá)的影響
　　 背景:巨噬細(xì)胞中膽固醇代謝調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。清道夫受體攝取氧化低密度脂蛋白導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇（FC）水平增加，同時(shí)ATP 盒轉(zhuǎn)運(yùn)體調(diào)節(jié)游離膽固醇的流出。游離膽固醇的過量聚集有細(xì)胞毒性，可通過合成膽固醇酯（CE）減輕不

5、利影響。ACAT1 促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)CE 聚集，從而導(dǎo)致泡沫細(xì)胞形成。泡沫細(xì)胞形成是早期AS的關(guān)鍵事件，但是GAS6在巨噬源性泡沫細(xì)胞形成中的作用尚不清楚。
　　 目的:觀察在巨噬源性泡沫細(xì)胞形成中，GAS6 對(duì)參與細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝關(guān)鍵基因：清道夫受體A（SR-A）、B（CD36）、?；o酶A：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1（ACAT-1）、ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）表達(dá)的調(diào)控作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系（TH

6、P-1），予佛波酯（PMA）孵育后，單核細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步予氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理形成泡沫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組包括泡沫細(xì)胞組即對(duì)照組（僅ox-LDL 100 mg/L）和GAS6 干預(yù)組（ox-LDL 100 mg/L+GAS6 100 ng/ml）。采用油紅O 染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的變化，分別運(yùn)用real timePCR法檢測(cè)SR-A、CD36、ABCA1和ACAT-1的mRNA 水平，western-blot 法檢測(cè)

7、上述基因的蛋白表達(dá)。采用酶比色法分別檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（TC）和膽固醇酯（CE）含量的變化。
　　 結(jié)果:GAS6 可減少細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的合成，并減少胞內(nèi)游離膽固醇流出率。給予100ng/ml GAS6 作用24 h后，細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量為68.98±1.14 mg/g，與泡沫細(xì)胞組61.86±1.12 mg/g 相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；游離膽固醇流出率為（15.55±0.75）％，與泡沫細(xì)胞組（21.88±1.04）％相比，有

8、顯著差異。GAS6 上調(diào)單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中SR-A mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)ACAT-1、ABCA1和CD36 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)論：GAS6在巨噬源性泡沫細(xì)胞形成中，減少胞內(nèi)膽固醇酯的合成及膽固醇流出率，可能是通過上調(diào)SR-A mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝取ox-LDL；下調(diào)ACAT-1、ABCA1和、CD36 mRNA和蛋白表達(dá)，抑制膽固醇酯合成，減少降低膽固醇流出，從而破壞巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的穩(wěn)

9、態(tài)，促進(jìn)泡沫細(xì)胞的形成。GAS6 可能因此促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。
　　 第三部分 GAS6 誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成中對(duì)過氧化物酶體增殖物活化受體表達(dá)的影響
　　 背景:過氧化物酶體增殖物活化受體（PPARs）參與調(diào)控巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞中膽固醇的代謝。
　　 目的:以THP-1 源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，體外觀察GAS6 作用下過氧化物酶體增殖物活化受體α（PPARα）、γ（PPARγ）的表達(dá)。
　　 方法:

10、體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞系（THP-1），在佛波酯（PMA）作用下誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，加入氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）后進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。實(shí)驗(yàn)包括對(duì)照組（僅ox-LDL）、不同濃度GAS6（10 ng/ml，100 ng/ml，200 ng/ml，400 ng/ml）干預(yù)組（24 h）以及不同時(shí)間（12 h，24 h，48 h）干預(yù)組（GAS6 100 ng/ml+ox-LDL 100mg/l）。油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的含量，運(yùn)用

11、real time PCR法檢測(cè)PPARα、PPARγ的mRNA 水平，western-blot 法檢測(cè)上述基因的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:GAS6下調(diào)PPARαmRNA和蛋白表達(dá)，但無濃度/時(shí)間-效應(yīng)依賴性；同時(shí)上調(diào)PPARγ mRNA和蛋白表達(dá)，且呈時(shí)間-效應(yīng)依賴性。
　　 結(jié)論:GAS6 可能通過PPARs 途徑，參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝。GAS6 對(duì)PPARα表達(dá)下調(diào)和對(duì) PPARγ表達(dá)上調(diào)兩種作用中和，導(dǎo)致對(duì)