Ghrelin抗動(dòng)脈粥樣硬化的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分、不同動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)人群外周血ghrelin 水平變化及意義
　　 Ghrelin與其受體結(jié)合后具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)。已知ghrelin 受體mRNA 在心血管組織分布廣泛，已有的研究顯示ghrelin可通過抑制炎癥、抗凋亡、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等不同途徑對(duì)心血管起到保護(hù)作用，然而其不同動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)人群外周血ghrelin水平變化如何，其變化是否與疾病相關(guān)等方面的研究尚未見報(bào)道。
　　

2、 目的：通過檢測(cè)不同人群外周血ghrelin 水平，初步探討ghrelin 水平變化情況及其臨床意義。
　　 方法及結(jié)果：將不同年齡、冠心病、肥胖、糖尿病患者納入研究對(duì)象，進(jìn)行對(duì)照研究。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)入選者外周血ghrelin水平，并同時(shí)抽血送檢入選者一般生化指標(biāo)如TC、TG、HDLc等，搜集臨床資料，分析一般臨床特征包括：年齡、性別、吸煙、BMI、高血壓等。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與青年組ghrelin水平（2.51±0.77）

3、ng/ml相比，老年組ghrelin水平（1.43±0.64）ng/ml顯著降低，p=0.009；老年組與中年組ghrelin水平（2.24±0.32）ng/ml相比，ghrelin降低程度亦呈現(xiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p=0.036，隨著年齡增長(zhǎng)，外周血ghrelin水平顯著降低，兩者之間顯著相關(guān)，rp=-0.564，p=0.015；經(jīng)校正后，冠心病組外周血ghrelin水平為（1.82±0.34）ng/ml，與對(duì)照組（3.00±0.29）n

4、g/ml相比，p=0.025，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；肥胖組（BMI 28Kg/m ≧ 2）外周血ghrelin濃度（1.87±0.89）ng/ml顯著低于對(duì)照組（2.77±1.49）ng/ml，p=0.047；糖尿病患者外周血ghrelin水平（2.41±0.74）ng/ml顯著低于對(duì)照組（3.35±13.02）mg/ml，p=0.013。
　　 結(jié)論：由上可知，隨著年齡增加，外周血ghrelin 水平呈現(xiàn)降低趨勢(shì)；冠心病、肥胖、

5、糖尿病均可導(dǎo)致外周血ghrelin 水平進(jìn)一步降低。為今后進(jìn)一步闡明ghrelin的功能奠定了一定基礎(chǔ)。
　　 第二部分、Ghrelin 通過抑制Th17細(xì)胞促炎作用延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展
　　 Th17細(xì)胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一種CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，可特異性產(chǎn)生IL-17，在炎癥性疾病中起著重要調(diào)節(jié)作用。已知，IL-17可促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α，IL-6 并與其發(fā)揮協(xié)同作用，加強(qiáng)炎癥反應(yīng)。由于AS是一種慢性炎癥

6、性疾病，且與其密切相關(guān)的IL-17、IL-6 及TNFα在厭食-惡液質(zhì)綜合癥發(fā)病中起著重要作用，ghrelin作為重要的食欲調(diào)節(jié)激素與上述炎癥因子的關(guān)系如何及其對(duì)AS的影響是否與上述炎癥因子有關(guān)尚未見報(bào)道。
　　 目的：通過檢測(cè)頸動(dòng)脈粥樣硬化患者外周血ghrelin 及Th17細(xì)胞含量的變化及觀察應(yīng)用ghrelin 干預(yù)患者PBMCs后上述炎癥因子的表達(dá)變化，初步探討ghrelin 延緩AS的病理機(jī)制。
　　 方法：經(jīng)頸

7、動(dòng)脈超聲檢查將入選對(duì)象分為兩組，即AS組37例和對(duì)照組31例（以頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度-IMT 1.2mm ≧為標(biāo)準(zhǔn)分組）。采用流式細(xì)胞分析法，檢測(cè)各組患者外周血Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞百分比；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)患者外周血Ghrelin含量，同時(shí)檢測(cè)患者外周血漿Th17 相關(guān)因子：白介素(IL)-17、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平；體外培養(yǎng)AS組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)Ghrelin干預(yù)后觀察上述炎癥因子水

8、平變化。
　　 結(jié)果：AS組患者外周血Th17/CD4+T細(xì)胞百分比為(1.92±0.52)%，明顯高于對(duì)照組(0.59±0.32)%，P<0.05；外周血Ghrelin濃度分別為(2.19±0.84)ng/ml、(3.54±1.04)ng/ml，差異具有顯著性，P<0.05；Th17 相關(guān)炎癥細(xì)胞因子(IL-17、IL-6、TNF-α)水平在AS組分別為（101.29±25.00）pg/ml、(7.67±3.58)pg/ml和

9、(17.98±3.16)pg/ml，顯著高于對(duì)照組(76.97±27.64)pg/ml、(3.89±3.50)pg/ml、(6.38±1.27)pg/ml，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05；應(yīng)用Ghrelin干預(yù)患者PBMCs后發(fā)現(xiàn)，上述炎癥因子分泌明顯受抑，且呈濃度依賴性，組間相比差異具有顯著性，P<0.05；患者血漿Ghrelin濃度與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.498，P<0.05），與Th17 相關(guān)炎癥因子(IL-17

10、、IL-6、TNF-α)水平呈負(fù)相關(guān)（相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.544、-0.363、-0.565，P<0.05）。
　　 結(jié)論：Ghrelin 通過抑制Th17 相關(guān)炎癥因子表達(dá)延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。
　　 第三部分、Ghrelin對(duì)THP-1細(xì)胞泡沫化過程中?；o酶A：膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶1表達(dá)的影響
　　 目前關(guān)于動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制存在著諸多學(xué)說，如損傷-反應(yīng)學(xué)說、炎癥學(xué)說等。然而，我們注意到，所有學(xué)說最終都

11、歸結(jié)為泡沫細(xì)胞形成，因此，研究泡沫細(xì)胞形成機(jī)制，對(duì)于有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。人?；o酶A：膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(Acyl-CoA:cholesterol acyltransferases，ACAT-1)催化細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇形成膽固醇酯，進(jìn)而形成泡沫細(xì)胞，在泡沫細(xì)胞形成過程中起著重要作用，抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)ACAT1 功能將有助于減少泡沫細(xì)胞形成，起到抗AS作用。我們?cè)谇捌趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ghrelin 本身可通過上調(diào)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

12、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1 促進(jìn)泡沫細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇流出，抑制泡沫細(xì)胞形成。因此，如果ghrelin 同時(shí)具有下調(diào)ACAT1的功能，抑制游離膽固醇的酯化過程，將有助于我們進(jìn)一步明確ghrelin 延緩AS 進(jìn)展的機(jī)制。此方面的研究尚未見報(bào)道。
　　 目的：研究單核/巨噬細(xì)胞分化成為泡沫細(xì)胞過程中Ghrelin對(duì)人?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(ACAT-1)表達(dá)以及細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)人源單核細(xì)胞系（

13、THP-1），由佛波酯（PMA）作用將其誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞，后者可在氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL）存在條件下進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（Ox-LDL）、不同濃度ghrelin干預(yù)組（10-5、10-6、10-7 mol/L）以及不同時(shí)間干預(yù)組（Ghrelin 10-5 mol/L+Ox-LDL 100mg/L）。巨噬細(xì)胞加入不同濃度的Ghrelin預(yù)孵兩小時(shí)后再加入Ox-LDL（100mg/L），作用24h；換液，各組均加入

14、10mg/L的apoA-I，并在含有0.3%BSA的RPMI1640 培養(yǎng)基、CO2培養(yǎng)箱中孵育12h，采用酶法，通過熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量化，采用油紅O染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴含量，運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)ACAT-1 mRNA水平，Western-blot法檢測(cè)ACAT-1 蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：Ghrelin可明顯減少THP-1 源性泡沫細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成；Ghrelin可顯著降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯含量，隨著Ghrel

15、in 濃度升高，胞內(nèi)膽固醇酯含量分別降低了(14.6±0.5)%，(28.3±1.5)%和(45.4±1.0)%，組間相比差異顯著，且胞內(nèi)膽固醇含量與ACAT-1 蛋白及mRNA表達(dá)明顯相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r 分別為0.968、0.943；Ghrelin 能顯著降低單核/巨噬細(xì)胞泡沫化過程中ACAT-1 mRNA 水平和蛋白表達(dá)，組間相比具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且此干預(yù)作用呈濃度依賴性；Ghrelin不同時(shí)間干預(yù)組之間油紅O染色結(jié)果顯示脂滴變化不