聚醚酯嵌段共聚物在血管組織工程中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究目的：探討聚醚酯嵌段共聚物[poly(ethyleneglycol-terephthalate)/poly(butyleneterephthalate)，PEGT/PBT]表面不同親疏水性對細(xì)胞生長的影響，對適合用作血管組織工程支架材料的聚醚酯材料做初步篩選；研究內(nèi)皮細(xì)胞在聚醚酯的粘附及與整合素相關(guān)的粘附結(jié)構(gòu)；制備聚醚酯多孔支架材料，進(jìn)行初步應(yīng)用評價(jià)；探討不同消毒滅菌方法對聚醚酯材料細(xì)胞相容性的影響；對壓力蒸汽滅菌對聚醚酯嵌段共聚物

2、性能的影響進(jìn)行研究。 方法：原代分離培養(yǎng)犬主動脈平滑肌細(xì)胞(SMCs)、犬頸外靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，鑒定后使用，培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞。選擇合成制備聚醚酯嵌段共聚物1000-T20、1000PEGT70/PBT30、600PEGT70/PBT30，表征平衡吸水率和靜態(tài)接觸角。分別進(jìn)行成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞在三種聚醚酯材料上的生長增殖試驗(yàn)。將600PEGT70/PBT30分為三組，即對照組，纖維連

3、接蛋白處理組(Fn-PEGT/PBT)和Ⅰ型膠原蛋白處理組(Col-PEGT/PBT)。比較HUVECs在三組膜上接種后的粘附、增殖，并進(jìn)行粘著斑蛋白(vinculin)和樁蛋白(paxillin)的免疫熒光染色觀察。分別用溶液澆鑄/粒子浸出、旋轉(zhuǎn)成型/粒子浸出法制備聚醚酯多孔膜和管支架，接種培養(yǎng)SMCs，進(jìn)行掃描電鏡觀察和組織學(xué)HE染色檢測。對γ射線輻射滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌、壓力蒸汽滅菌、紫外線照射滅菌和70％乙醇消毒后的聚醚酯材料細(xì)胞

4、毒性和細(xì)胞相容性進(jìn)行評價(jià)研究；對壓力蒸汽滅菌后的聚醚酯膜片，進(jìn)行1HNMR、ATR-FTIR、DSC等表征，掃描電鏡觀察，靜態(tài)接觸角和動態(tài)接觸角測定，并與紫外線照射滅菌、70％乙醇消毒進(jìn)行交叉處理后再評價(jià)細(xì)胞相容性。 結(jié)果：不同聚醚酯膜的平衡吸水率大小為1000PEGT70/PBT30＞1000-T20＞600PEGT70/PBT30，接觸角大小為1000PEGT70/PBT30＜1000-T20＜600PEGT70/PBT30

5、，顯示1000PEGT70/PBT30比其他兩種聚醚酯更親水。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在更為親水的1000PEGT70/PBT30表面細(xì)胞生長不良，而在中等親水的1000-T20和600PEGT70/PBT30上犬平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與之相比更多，均有顯著性差異(P＜0.05)；人成纖維細(xì)胞和HUVECs的增殖也更多，且600PEGT70/PBT30與之相比有顯著性差異(P＜0.05)。600PEGT70/PBT30能支持HUVECs的粘

6、附和增殖。HUVECs在600PEGT70/PBT30膜上20min的粘附率達(dá)45.0％±6.5％，6h的粘附率達(dá)85.3％±7.9％。粘著斑蛋白免疫熒光染色顯示20min時600PEGT70/PBT30上內(nèi)皮細(xì)胞邊緣有連成線的點(diǎn)狀染色，顯示形成了focalcomplexes；2h后顯示分布在內(nèi)皮細(xì)胞外圍豐富的，卵圓形長棒狀染色，顯示發(fā)展形成了focaladhesion，并且focaladhesion中信號傳遞分子樁蛋白在6h有著與粘著

7、斑蛋白相似的分布。纖維連接蛋白和Ⅰ型膠原蛋白處理可促進(jìn)HUVECs在600PEGT70/PBT30膜上的增殖，而且纖維連接蛋白可增加HUVECs在600PEGT70/PBT30上20min、2h的粘附率，促進(jìn)細(xì)胞在20min時即形成focaladhesion。在溶液澆鑄/粒子浸出的600PEGT70/PBT30多孔膜上，平滑肌細(xì)胞能粘附生長，但孔壁形貌、孔隙大小對平滑肌細(xì)胞形成多層組織有影響；對600PEGT70/PBT30管，旋轉(zhuǎn)動態(tài)

8、接種、濾過接種的效果不理想，可能是因?yàn)橹苽涞墓軆?nèi)外表面不開放、內(nèi)部孔隙連通程度不足、孔壁不光滑規(guī)整影響細(xì)胞粘附生長。不同消毒滅菌方法處理后聚醚酯膜片細(xì)胞毒性不大于1級，細(xì)胞在紫外線照射滅菌、70％乙醇消毒的膜片上粘附生長良好；但在γ射線輻射滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌和壓力蒸汽滅菌的膜片上不能粘附生長。細(xì)胞不能粘附生長與所測試的細(xì)胞類型和細(xì)胞接種密度無關(guān)，在明膠和膠原蛋白處理膜片后細(xì)胞仍不能粘附生長。對壓力蒸汽滅菌后的600PEGT70/PBT3

9、0膜片進(jìn)行1HNMR、ATR-FTIR、特性粘度表征發(fā)現(xiàn)滅菌前后結(jié)果無差異，DSC分析顯示結(jié)晶度增加了3％，平衡吸水率測定表明降低了6％。靜態(tài)接觸角滅菌后為34.5°±0.9°，與滅菌前38.9°±0.7°相比有顯著性差異(P＜0.05)。滅菌后動態(tài)接觸角的前進(jìn)角θa和后退角θr也均減小，顯示材料表面更親水。將壓力蒸汽滅菌處理后的600PEGT70/PBT30膜片再經(jīng)70％乙醇消毒后，L929細(xì)胞可以粘附生長；或再經(jīng)紫外線照射滅菌后L9

10、29細(xì)胞也可生長。作為對照的降解膜片，特性粘度下降為0.90dL/g，在70％乙醇消毒和紫外線照射滅菌后L929細(xì)胞可粘附生長，而在壓力蒸汽滅菌后細(xì)胞同樣不能粘附生長。 結(jié)論：與更為親水的1000PEGT70/PBT30相比，1000-T20和600PEGT70/PBT30具有適宜血管組織相關(guān)細(xì)胞粘附生長的中等親水性，犬平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均能較好的粘附生長和增殖。600PEGT70/PBT30能支持臍靜

11、脈內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和增殖，可以形成focalcomplexes和focaladhesion粘附結(jié)構(gòu)。在600PEGT70/PBT30制備的多孔膜上，平滑肌細(xì)胞能粘附增殖形成多層。這些試驗(yàn)結(jié)果第一次提供證據(jù)表明600PEGT70/PBT30聚醚酯嵌段共聚物有良好的血管細(xì)胞相容性，具有在血管組織工程中應(yīng)用的價(jià)值。旋轉(zhuǎn)成型/粒子浸出法制備的600PEGT70/PBT30管，因內(nèi)外表面不開放，孔隙連通程度不足，細(xì)胞接種生長效果不理想，這與成型方法

12、本身密切相關(guān)。對PEGT/PBT在血管組織工程的應(yīng)用，應(yīng)采取更多的方法制備血管支架，如相分離/凍干法、電紡絲法等，由此才能制備合適的管形支架和獲得600PEGT70/PBT30血管支架合適的構(gòu)建模式。聚醚酯材料紫外線照射滅菌或70％乙醇消毒后細(xì)胞能粘附生長。γ射線輻射滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌和壓力蒸汽滅菌后，接種細(xì)胞不能生長與浸提物的影響無關(guān)，可能是聚醚酯材料在上述滅菌處理后產(chǎn)生的性質(zhì)變化造成細(xì)胞不能粘附生長。對于壓力蒸汽滅菌后的600PEG