高膽紅素血癥對大鼠近-遠期學(xué)習(xí)記憶的影響及堿性成纖維細胞生長因子治療作用的實驗研究.pdf

1、目的:該實驗旨在利用突觸水平上反映學(xué)習(xí)記憶的理想模型---長時程增強(long term potentiation LTP)及行為學(xué)的方法論證不同水平的高膽紅素血癥對大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)近、遠期的影響,同時結(jié)合形態(tài)學(xué)的定量定性指標(biāo),進一步探討堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor bFGF)在膽紅素源性腦損傷方面的治療作用,以期改善臨床病例的遠期預(yù)后.方法 :⑴ 模型建立:1周齡健康Wister

2、大鼠隨機分成對照組(CG)、實驗1組(T<,1>G)、實驗2組(T<,2>G)及治療組(BTG).T<,1>G、T<,2>G和BTG大鼠腹腔內(nèi)注射不同濃度膽紅素溶液以建立高膽紅素血癥模型.重氮反應(yīng)法測定血及海馬外腦組織膽紅素濃度,同時光鏡觀察腦片確定模型建立的成功.⑵ bFGF治療方法:治療組大鼠于模型制作后30min、1d、3d、5d、7d分別經(jīng)腹腔注射bFGF, 6IU/g.次,對照組注射等量磷酸鹽緩沖溶液.⑶ 形態(tài)學(xué)檢測:2d、8

3、d、28d、60d分批處死大鼠,海馬組織分別用福爾馬林、4﹪多聚甲醛和戊二醛固定,分送光鏡觀察膽紅素顆粒在腦組織的沉積,硫堇染色觀察尼氏體數(shù)量形態(tài)、免疫組化測量GAP-43陽性神經(jīng)元光密度值觀察功能性再生的程度,另有部分送檢電鏡.⑷ 行為學(xué)測試:按照經(jīng)典Morris水迷宮法測試定位航行試驗 (place navigation test PNT)及空間探索實驗(spatial probe test SPT).分別記錄大鼠的逃避潛伏期(es

4、cape latency EL),各象限的游泳距離及其所占百分比、跨平臺相應(yīng)位置的次數(shù)及比例,同時觀察大鼠搜索平臺路線圖的特征.⑸ 神經(jīng)電生理學(xué)--LTP:單籠飼養(yǎng)至60d齡大鼠,成功埋植電極后,LTP激發(fā)裝置自動記錄單脈沖刺激下的群峰電位(population spike PS) 及高頻串刺激(high frequency stimulationHFS)誘發(fā)LTP,觀察PS幅值的變化. 結(jié)果 :1. 動物模型的鑒定:(1) 大鼠活體觀

5、察:T<,1>G少數(shù)有呼吸增快、煩躁;T<,2>G普遍反應(yīng)低下,異常神經(jīng)體征多見,提尾抬頭反射罕見,死亡例數(shù)多;CG未見異常.(2) 腦標(biāo)本大體觀察:CG及T<,1>G均無肉眼可見異常,T<,1>G可見海馬區(qū)、小腦、基底核部位散在深淺不一黃染區(qū).光鏡下腦片僅 T<,2>G可見散在膽紅素顆粒沉積.(3) 膽紅素濃度:T<,1>G及T<,2>G的血清及腦組織膽紅素濃度均明顯高于CG,以T<,2>G更明顯,指標(biāo)差異有顯著性或極顯著性(P<0.

6、01或P<0.001).2. 形態(tài)學(xué)指標(biāo):(1) GAP-43: T<,1>G及T<,2>G中GLIN均較CG明顯增多,神經(jīng)元突起網(wǎng)絡(luò)明顯(T<,1>G:P<0.05;T<,2>G: P<0.01),T<,2>G變化明顯高于T<,1>G.(2) 尼氏體:CG海馬區(qū)尼氏體數(shù)量穩(wěn)定;實驗第2d,T<,1>G、 T<,2>G尼氏體開始出現(xiàn)脫失,第28d尼氏體數(shù)目降至最低,統(tǒng)計學(xué)差異明顯(P<0.05、P<0.01 );T<,2>G尚可見噬神經(jīng)

7、細胞現(xiàn)象.(3) 電鏡:T<,1>G出現(xiàn)少量異染色質(zhì)及異常管網(wǎng)結(jié)構(gòu);脫髓鞘樣變性多見.T<,2>G全視野下神經(jīng)細胞膜皺縮、破裂,高密度脂褐素樣物質(zhì)沉積多見;髓鞘樣變性、神經(jīng)水腫嚴(yán)重;小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞異?；钴S.3. 學(xué)習(xí)記憶檢測:(1) Morris水迷宮:T<,2>G及T<,1>G的潛伏期與CG相比均明顯延長(P<0.01).CG、T<,1>G大鼠在原平臺象限泳距占總泳距的百分比均為各自相應(yīng)比例中的最高,跨原平臺次數(shù)比例高達80

8、.2﹪和76.11﹪,提示T<,1>G記憶能力未受明顯損傷,而T<,2>G大鼠運動軌跡呈"遠離平臺周邊型",統(tǒng)計顯示各象限無顯著差別(P>0.05),其跨原平臺或平臺相應(yīng)位置的總次數(shù)也明顯降低.(2) LTP測定:實驗動物總數(shù)的95﹪成功誘發(fā)LTP.單脈沖刺激所誘發(fā)的PS平均幅值組間無顯著差異.高頻刺激誘發(fā)的達標(biāo)LTP平均幅值,其中CG增加到217.43﹪±35.21﹪,T1G、T2G則只增強到176.29﹪±14.55﹪和144.36

9、﹪±11.72﹪,統(tǒng)計學(xué)差異明顯(P<0.05).4. bFGF治療效果:治療組同時段GAP-43表達水平較未治療組增加,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成更加明顯;尼氏體數(shù)量也在實驗第28d全面表現(xiàn)出有統(tǒng)計學(xué)差異的增多.電鏡下治療組神經(jīng)細胞膜完整、飽滿,脂褐素樣物質(zhì)不明顯,腫脹程度有明顯減輕.水迷宮實驗中,BTG的平均潛伏期下降至48.7±4.8s,跨越平臺的總次數(shù)也明顯增加;bFGF的治療還使治療組LTP的幅差平均增加13.9﹪,與未治療組相比差異明顯(

10、以上各項指標(biāo)均為P<0.05或P<0.01).但治療組的各項指標(biāo)改善的程度較正常對照組仍有明顯的差異.結(jié)論:1.高膽紅素血癥可以造成實驗動物神經(jīng)系統(tǒng)的肯定性損傷,其損傷病理學(xué)基礎(chǔ)是病變區(qū)(該實驗中為海馬部位)神經(jīng)細胞數(shù)量的減少和正常形態(tài)的破壞.2.高膽紅素血癥可以減低模型動物遠期的學(xué)習(xí)記憶能力,電生理指標(biāo)改變顯著,提示高膽紅素狀態(tài)下的神經(jīng)細胞數(shù)量的減少和突觸功能的喪失不能靠機體自身完全修復(fù).3.相對"安全"的血清膽紅素水平仍然可以造成神