新型TiO2高性能納米纖維光敏劑的研制及對HeLa細(xì)胞MPP8基因的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：
　　1.制備具有不同晶體結(jié)構(gòu)的二氧化鈦（TiO2）高性能納米纖維，觀察其對宮頸癌腫瘤細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的光動(dòng)力作用影響，探討其作為光敏劑潛在應(yīng)用于臨床光動(dòng)力治療的可行性。
　　2.通過宮頸癌患者光動(dòng)力治療后的基因表達(dá)譜芯片篩選靶基因MPP8，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)檢測其在HeLa細(xì)胞增殖和凋亡中的作用。
　　3.檢測TiO2復(fù)合納米纖維的光動(dòng)力作用后HeLa細(xì)胞MPP8的表達(dá)差異，探討TiO2復(fù)合納米纖維作為光敏劑在腫瘤

2、光動(dòng)力治療中的相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.將層狀鈦酸鹽H2Ti3O7納米纖維經(jīng)煅燒過程和水熱反應(yīng)高溫及熱處理，制作不同晶型的TiO2復(fù)合納米纖維（銳鈦礦、TiO2(B)相、以及銳鈦礦/TiO2(B)混相結(jié)構(gòu)），并利用X射線衍射儀(XRD)、掃描電子顯微鏡(SEM)、透射電子顯微鏡(TEM)對所得到的新型復(fù)合納米纖維進(jìn)行表征解析。
　　2.將制備的納米纖維加入至宮頸癌腫瘤細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中一起培養(yǎng)；熒光顯微鏡觀

3、察貼壁HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；MTT實(shí)驗(yàn)檢測HeLa細(xì)胞在光動(dòng)力作用之后的增殖變化；流式細(xì)胞儀檢測納米纖維在光動(dòng)力作用下對HeLa細(xì)胞凋亡的影響。
　　3.分析宮頸癌患者光動(dòng)力治療后的基因表達(dá)譜芯片，篩選靶基因M-期磷蛋白8（M-phase phosphoprotein8，MPP8）；免疫組化檢測MPP8在宮頸癌患者光動(dòng)力治療組與非治療組中的表達(dá)差異。
　　4.利用靶向MPP8基因沉默的RNAi慢病毒載體感染HeLa細(xì)胞，

4、含嘌呤霉素的選擇性培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定干擾MPP8的HeLa細(xì)胞，構(gòu)建穩(wěn)定沉默MPP8基因的人宮頸癌HeLa細(xì)胞株；利用MTT實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀觀察MPP8對HeLa細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　5.利用Western blot及qRT-PCR檢測經(jīng)TiO2復(fù)合納米纖維的光動(dòng)力作用后HeLa細(xì)胞MPP8的表達(dá)差異，探討TiO2復(fù)合納米纖維作為光敏劑在腫瘤光動(dòng)力治療中的相關(guān)作用機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.通過對H2T

5、i3O7納米纖維的煅燒和水熱處理，分別制備得到四種晶型的TiO2納米纖維：單晶TiO2(B)（T(B))、單晶anatase(T(A))、煅燒混相anatase/TiO2(B)(T(AB)-T)、水熱煅燒混相anatase/TiO2(B)（T(AB)-H)，并通過XRD、SEM、TEM等方法準(zhǔn)確證實(shí)了這些TiO2納米纖維的晶型結(jié)構(gòu)和一維度形貌特征。
　　2.將制備的TiO2納米纖維光敏劑與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后，顯微鏡下觀察到它們有

6、向HeLa細(xì)胞內(nèi)聚集的趨勢，并具有較好的生物相容性。MTT實(shí)驗(yàn)檢測了四種晶型納米纖維與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后，HeLa細(xì)胞的增殖變化：無光動(dòng)力作用存在時(shí)，納米纖維對HeLa細(xì)胞的增殖沒有影響，而在光動(dòng)力作用下HeLa細(xì)胞增殖明顯受抑，且四種納米纖維的光動(dòng)力作用之間也存在差異，其中T(AB)- H效率最高。流式細(xì)胞儀檢測了納米纖維作為光敏劑進(jìn)行光動(dòng)力作用后對HeLa細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示四種納米纖維的光動(dòng)力作用使得HeLa細(xì)胞的凋亡顯著增

7、加并存在組內(nèi)差異。
　　3.臨床宮頸癌病人光動(dòng)力治療后的基因表達(dá)譜芯片檢測顯示，MPP8在癌組織中較癌旁組織顯著升高。免疫組化顯示MPP8在臨床宮頸癌病人光動(dòng)力治療與非治療組之間存在表達(dá)差異，光動(dòng)力治療組MPP8表達(dá)較低；Western blot及qRT-PCR檢測也顯示經(jīng)TiO2復(fù)合納米纖維的光動(dòng)力作用后HeLa細(xì)胞的MPP8表達(dá)降低。
　　4.利用靶向沉默MPP8基因的RNAi慢病毒載體感染HeLa細(xì)胞，之后利用含嘌呤霉

8、素的選擇性培養(yǎng)基篩選出了穩(wěn)定干擾MPP8的HeLa細(xì)胞，成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默MPP8基因的人宮頸癌HeLa細(xì)胞株。熒光顯微鏡下觀察到感染效率達(dá)70％以上，qRT-PCR和Western blot證明MPP8表達(dá)水平下降了約65~70%。
　　5. MTT結(jié)果證明HeLa細(xì)胞在沉默MPP8基因后增殖受到顯著抑制，克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MPP8沉默組的HeLa細(xì)胞集落數(shù)量及克隆形成率明顯降低。流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示MPP8的沉默導(dǎo)

9、致了HeLa細(xì)胞的周期阻滯，說明MPP8可通過對細(xì)胞周期的影響而對HeLa細(xì)胞的增殖產(chǎn)生影響。細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果顯示MPP8沉默后HeLa細(xì)胞的凋亡比率明顯升高，推測MPP8可抑制HeLa細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.制備了具備潛在應(yīng)用價(jià)值可用于臨床光動(dòng)力治療的新型二氧化鈦（TiO2）復(fù)合納米纖維光敏劑，其具有較好的生物相容性，并在光動(dòng)力作用下可引起宮頸癌腫瘤細(xì)胞系HeLa細(xì)胞的凋亡。
　　2.發(fā)現(xiàn)了具有臨床應(yīng)用價(jià)值