抑制枯否細(xì)胞可以減輕肝缺血再灌注引起的腎損傷.pdf

1、目的：
　　 建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型,按時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本,對(duì)血清尿素氮(BUN),血清肌酐(Cr),腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化物的終產(chǎn)物-丙二醛(MDA)及血清中腫瘤壞死因子(TNF-α)進(jìn)行測(cè)定；對(duì)腎組織進(jìn)行MMP-2,MMP-9蛋白測(cè)定,探討氯化釓抑制枯否細(xì)胞對(duì)大鼠肝缺血再灌注所致腎損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　 材料與方法
　　 1、材料
　　 選擇周齡為7～8周雄性Wistar大鼠100只,體重為180～

2、220g,按體重隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(氯化釓+肝缺血再灌注)和對(duì)照組(生理鹽水+肝缺血再灌注)。氯化釓購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；血生化相關(guān)試劑購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司；TNF-α試劑盒(美國(guó)BD公司)；丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗大鼠MMP-9抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)；兔抗大鼠MMP-2抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。HITACHI-7600A全自動(dòng)生化分析儀；芬蘭Multlskan MK-3型全

3、自動(dòng)多功能型酶標(biāo)儀；圖片分析采用MetaMorph/Evolution MP5.0/BX51顯微圖象分析系統(tǒng)。
　　 2、方法
　　 實(shí)驗(yàn)組術(shù)前24h、48h 經(jīng)鼠尾靜脈注射氯化釓(10mg/kg),對(duì)照組給予等量生理鹽水。參照Kobayashi法建立左半肝缺血再灌注模型(阻斷左肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈及肝管),缺血均為60分鐘,按再灌注后0.5h、1h、6h、12h、24h時(shí)點(diǎn)采集標(biāo)本,每組每個(gè)時(shí)點(diǎn)10只大鼠。麻醉藥選擇10％水

4、合氯醛,按3ml/kg計(jì)量腹腔注射給藥。免疫組化標(biāo)本固定均采用4％多聚甲醛0.1mol/L磷酸緩沖液(pH=7.3)。經(jīng)膈肌心臟穿刺取血后,離心5min,留取上清液,血清由超低溫冰箱保存,集中測(cè)定。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中TNF-α伍的水平。取大鼠左腎,其中左腎中1/3腎組織均漿后TBA法測(cè)定MDA；取左腎下1/3腎組織2×1×0.3cm行免疫組化染色。免疫組化結(jié)果在400倍光鏡下觀察,胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。每張切片取5個(gè)不重

5、疊的高倍視野,測(cè)量IOD值,求出其均值,代表本張切片的平均IOD值。IOD為累計(jì)積分光密度。所有計(jì)量指標(biāo)均用mean士SD表示。所有數(shù)據(jù)均用專業(yè)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用t檢驗(yàn)。
　　 結(jié)果：
　　 1、血清BUN
　　 再灌注后1h開(kāi)始,實(shí)驗(yàn)組血清BUN低于對(duì)照組,且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2、血清Cr
　　 再灌注后,各時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組血清

6、Cr均低于對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組在再灌注后6、12及24h時(shí)點(diǎn)與對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.05)。
　　 3、血清TNF-α
　　 再灌注后,實(shí)驗(yàn)組各時(shí)點(diǎn)的血清TNF-α均低于對(duì)照組,有顯著差異(P<0.05)。且兩組走勢(shì)基本相同,12h達(dá)到高峰,之后有下降趨勢(shì)。
　　 4、腎組織勻漿MDA
　　 再灌注后6h、12h、24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組MDA明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 5、腎組織MMP-

7、2染色
　　 再灌注后,兩組染色的IOD值均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì),12h后上升趨勢(shì)變緩。實(shí)驗(yàn)組再灌注后各時(shí)點(diǎn)IOD值均低于對(duì)照組,且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在顯著性差異(P<0.05)。陽(yáng)性表達(dá)部位主要在皮質(zhì)深層近曲小管上皮細(xì)胞、腎小管周?chē)难軆?nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。
　　 6、腎組織MMP-9染色
　　 再灌注后,兩組IOD值隨時(shí)間呈遞增走勢(shì),實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組增長(zhǎng)速度緩慢,各時(shí)點(diǎn)IOD值均低于對(duì)照組

8、,且6、12及24h時(shí)點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間存在顯著性差異(P<0.05)。陽(yáng)性表達(dá)部位與MMP-2陽(yáng)性表達(dá)部位相近,主要在皮質(zhì)深層近曲小管上皮細(xì)胞、腎小管周?chē)难軆?nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞。
　　 結(jié)論：
　　 本研究通過(guò)建立大鼠肝缺血再灌注損傷模型,按再灌注后不同時(shí)點(diǎn)分別采集標(biāo)本,測(cè)定血清BUN、血清Cr、血清TNF-α、腎組織MDA以及對(duì)腎組織行MMP-2、MMP-9免疫組化染色,探討氯化釓抑制枯否細(xì)胞對(duì)大鼠肝缺血再灌注所