大鼠全肝缺血再灌注后肝腎及線粒體損傷的機(jī)制和防護(hù).pdf

1、背景和目的：
　　 肝臟缺血再灌注損傷為肝臟外科常見(jiàn)的病理生理過(guò)程。特別是90年代后，隨著肝移植例數(shù)的逐年增加，供肝短缺的矛盾日益嚴(yán)重，移植界開(kāi)始關(guān)注從無(wú)心跳供者(NHBD)獲取供肝，對(duì)肝移植過(guò)程中的缺血再灌注損傷的研究日趨重視，從而廣泛開(kāi)展了對(duì)全肝缺血再灌注損傷的研究。肝臟的缺血及再灌注過(guò)程，勢(shì)必給其它臟器帶來(lái)?yè)p傷，肝缺血及門(mén)靜脈瘀血可產(chǎn)生大量有害炎癥介質(zhì)，包括酸性代謝產(chǎn)物、內(nèi)毒素、氧自由基、腫瘤壞死因子和其它炎癥介質(zhì)。這些有

2、害炎癥介質(zhì)在肝血流恢復(fù)后立即傾注入肺，造成急性肺損傷和呼吸衰竭，流經(jīng)腎臟組織，造成腎功能不全。門(mén)脈血流阻斷后可使門(mén)脈壓力增加，引起胃腸道毛細(xì)血管高壓性受損，微循環(huán)障礙，消化道粘膜水腫、出血、壞死，形成內(nèi)毒素血癥及腸道細(xì)菌移位，給全身臟器帶來(lái)威脅。腎臟是人體一個(gè)重要的代謝器官，其功能下降嚴(yán)重影響病人手術(shù)后的生存率，給移植成功帶來(lái)了巨大的困難。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)方法建立大鼠全肝缺血再灌注的創(chuàng)傷模型，觀察再灌注損傷中炎性反應(yīng)、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，H2

3、S/CSE體系、CaN信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化，以尋找有效的干預(yù)措施。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)方法建立大鼠全肝缺血再灌注的創(chuàng)傷模型。第一部分缺血再灌注實(shí)驗(yàn)分組：雄性Wistar大鼠88只，隨機(jī)分為11組，每組8只：
　　 1.正常對(duì)照組；
　　 2.全肝缺血20min組，再灌注2h、6h、12h、24h、48h、72h組；
　　 即20min、20min+2h、20min+6h、20min+12h、20mi

4、n+24h、20min+48h、20min+72h。
　　 3.全肝缺血40min組，再灌注6h、72h組；
　　 即40min、40min+6h、40min+72h。
　　 第一部分藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：雄性Wistar大鼠96只，隨機(jī)分為12組，每組8只；
　　 1.FK506空白對(duì)照組：假手術(shù)后給予腹腔注射FK506(0.1mg/kg)。
　　 螺內(nèi)酯空白對(duì)照組：螺內(nèi)酯每天灌胃(20mg/kg)

5、持續(xù)6天后假手術(shù)。
　　 甲潑尼龍(MP)空白對(duì)照組：假手術(shù)后立即給予腹腔注射MP(30mg/kg)。
　　 NaHS空白對(duì)照組：假手術(shù)后立即給予腹腔注射N(xiāo)aHS(28ymol/kg)。
　　 2.缺血20min再灌6h藥物干預(yù)組：
　　 20min+6h+FK506組：再通后腹腔注射FK506，再灌注后6h處死。
　　 20min+6h+螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯每天灌胃，6天后手術(shù)。
　　 20

6、min+6h+MP組：再通后給予腹腔注射MP，再灌注后6h處死。
　　 20min+6h+NaHS組：再通后給予腹腔注射N(xiāo)aHS，再灌注后6h處死。
　　 3.缺血40min再灌6h藥物干預(yù)組：
　　 40min+6h+螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯術(shù)前6天每天灌胃，再灌注后6h處死。
　　 40min+6h+MP組：再通后立即給予腹腔注射MP，再灌后6h處死。
　　 4.缺血40min再灌72h藥物干預(yù)組：<

7、br>　　 40min+72h+螺內(nèi)酯組：螺內(nèi)酯術(shù)前6天每天灌胃，再灌后72h處死。
　　 40min+72h+MP組：再通后立即給予腹腔注射MP，再灌后72h處死。
　　 第二部分線粒體損傷及干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：雄性Wistar大鼠80只，隨機(jī)分為10組，每組8只：
　　 正常對(duì)照組、20min+6h、藥物干預(yù)及藥物空白組。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)手術(shù)方法建立大鼠全肝缺血再灌注的創(chuàng)傷模型，動(dòng)態(tài)檢測(cè)血漿H2S、丙二

8、醛(MDA)、血管緊張素II(angiotensin II，Ang II)、醛固酮(aldosterone，ALD)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、丁酰膽堿酯酶(BuChE)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、胱抑素C(CysC)的變化，檢測(cè)肝臟及腎臟CSE活性，細(xì)胞間粘附分子(ICAM—1)、核因子NF-κB含量，腎損傷分子-1(KIM-1)含量，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)含量，同時(shí)光鏡HE染色下觀察其二者的病理變化及線粒

9、體呼吸功能、膜電位及線粒體ATP酶的變化。應(yīng)用H2S供體NaHS、CaN抑制劑FK506及醛固酮拮抗劑螺內(nèi)酯和甲潑尼龍進(jìn)行干預(yù)，觀察上述指標(biāo)變化，進(jìn)一步研究H2S、CaN及醛固酮在全肝缺血再灌注損傷中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及各信號(hào)通路之間的相互作用，同時(shí)研究NaHS、CaN抑制劑FK506及醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯和甲潑尼龍對(duì)肝腎的干預(yù)作用。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，血清ALT、血清CysC、血清TNF

10、-α、血清MDA、血漿Ang II水平、腎臟KIM-1水平、肝臟ICAM-1、NF-κB水平在缺血及再灌注后開(kāi)始升高，再灌注6h達(dá)到峰值。血漿BuChE缺血及再灌注后逐漸降低，于再灌注24h時(shí)降到最低值，于再灌注72h恢復(fù)到正常水平。血漿ALD、腎臟ICAM-1、NF-κB在全肝缺血20min增高并達(dá)到高峰，再灌注后開(kāi)始降低。肝臟ALD同樣在缺血20min后開(kāi)始升高，但不同于血漿ALD，于再灌注2h達(dá)到峰值。血清H2S在缺血20min時(shí)

11、降低，于再灌注2h恢復(fù)正常水平，然后隨再灌注時(shí)間逐漸升高，6h達(dá)到峰值，隨后逐漸降低，于再灌注12h再次恢復(fù)到基線水平。肝腎CSE酶活性在缺血20min顯著降低，再灌注后各組CSE酶活性均較缺血20min組升高。肝腎CaN在缺血20min時(shí)開(kāi)始降低降低，且隨再灌注時(shí)間逐漸降低，分別于12h和6h達(dá)到最低值。FK506、螺內(nèi)酯、MP、NaHS干預(yù)均使血清TNF-α、MDA、腎臟KIM-1、肝腎ICAM-1、NF-κB水平降低；螺內(nèi)酯干預(yù)使

12、血漿Ang II降低，血漿ALD升高；FK506、螺內(nèi)酯、NaHS和MP使CaN含量降低；NaHS干預(yù)提高血清H2S和組織CSE酶活性；MP干預(yù)降低血清ALT水平，提高血漿BuChE含量。
　　 第二部分結(jié)果：于正常對(duì)照組比較，缺血再灌注后，肝腎線粒體ATP酶活性改變，RCR、P/O、膜電位均降低，藥物干預(yù)后，各項(xiàng)指標(biāo)均有不同程度的改善。
　　 結(jié)論：
　　 全肝缺血再灌注后可造成肝臟本身和腎臟的損傷，于再灌注6