SiRNA干擾SLC7a8對NRK-52E細胞攝取左旋多巴的影響.pdf

1、目的:通過RNA干擾(RNAi)技術(shù)選擇性下調(diào)高血壓相關(guān)基因SLC7a8的表達,探討對大鼠腎小管上皮細胞(NRK一52E)攝取左旋多巴的影響。
　　 方法:設(shè)計并合成3個針對大鼠SLC7a8基因的特異性siRNA片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3),以含非特異性編碼序列的siRNA-con為對照。將上述3個片段及陰性對照通過陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染NRK-52E內(nèi),通過流式細胞儀估算轉(zhuǎn)染效率后經(jīng)RT-PCR初步篩選高

2、效率干擾片段,用western-blot檢測蛋白水平的干擾效率,采用紫外分光光度法檢測空白對照組、siRNA-con轉(zhuǎn)染組和SLC7a8基因特異性沉默組不同時間點6、12、24、36、48、60、72、120min各組NRK-52E內(nèi)左旋多巴的濃度,并繪制濃度-時間變化趨勢曲線。
　　 結(jié)果:流式細胞儀測定siRNA轉(zhuǎn)染NRK-52E效率為94％,RT-PCR初步篩選結(jié)果顯示siRNA-1、3干擾效率較高,兩者的光密度比值與對照

3、組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),western-blot檢測顯示siRNA-3組在蛋白水平的干擾效率較高,其光密度比值與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而對照組(siRNA-con)與空白對照組(Blank)的SLC7a8表達差異不明顯,光密度比值無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。通過紫外分光光度法檢測NRK-52E對左旋多巴的吸收結(jié)果顯示干擾組不同時間點6、12、24、36、48、60、72、120min各組細胞內(nèi)

4、左旋多巴濃度均低于siRNA-con轉(zhuǎn)染組和空白對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),濃度一時間變化趨勢差異較明顯；對照組siRNA-con與空白對照組(Blank)相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論:RNA干擾技術(shù)能選擇性下調(diào)大鼠腎小管上皮細胞SLC7a8基因的表達水平；slc7a8基因特異沉默后NRK-52E對左旋多巴的吸收在各個不同時間點6、12、24、36、48、60、72、120min均降低,濃度