骨化三醇對晚期糖基終末產物誘導的NRK52E細胞EMT的影響.pdf

1、目的：
　　在糖尿病微環(huán)境中，晚期糖基化終產物（advanced glycation end products，AGEs）對腎臟細胞產生損害作用，主要機制是通過誘導氧化應激和導致腎臟細胞上皮細胞間充質轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）。我們用AGEs刺激腎小管上皮細胞，觀察上皮細胞的 EMT，并且檢測細胞的 AGEs受體（receptor for advanced glycation

2、 end products, RAGE）的表達及NF-κB的磷酸化水平的改變等。骨化三醇對腎臟有重要保護作用，但保護機制尚不明確。用骨化三醇對細胞進行預處理，進行相應的觀察，以探討骨化三醇是否對AGEs誘導的腎小管上皮細胞的EMT產生影響。
　　方法：
　　1.不同濃度的AGE-BSA(0、100、200、300μg/ml)與相應濃度的BSA孵育 NRK52E細胞48h，Western blot檢測上皮標志物E-cadher

3、in間質標志物α-SMA以及AGEs特異性受體RAGE表達的改變。
　　2.實驗分組：空白對照組、低濃度(10nmol/L)骨化三醇組、高濃度(100nmol/L)骨化三醇組，Western blot檢測經骨化三醇處理細胞后的E-cadherin和α-SMA的水平變化。
　　3.實驗分組：空白對照組，AGEs處理組、低劑量骨化三醇+AGEs處理組，高劑量骨化三醇+AGEs處理組。Western blot、熒光定量 PCR、免

4、疫熒光觀察 E-cadherin、α-SMA的表達變化及普通顯微鏡下細胞形態(tài)改變，并觀察細胞 RAGE的變化和NF-κB磷酸化的水平改變。
　　4.實驗分組：空白對照組，AGEs誘導組，50g/ml抗RAGE中和抗體+AGEs組，Western blot檢測E-cadherin、α-SMA的相對變化。
　　5.實驗分組：對照組、AGEs處理組、100nmol/L骨化三醇預處理+AGEs組、100nmol/L骨化三醇＋IMD0

5、354預處理+AGEs組，Western blot檢測RAGE的相對變化，熒光定量PCR檢測RAGE的mRNA相對表達變化。
　　6. SPSS20.0統(tǒng)計軟件做單因素方差分析組間差異。
　　結果：
　　1.不同濃度的AGEs孵育NRK52E細胞48h以后，上皮標志物E-cadherin下調，間質標志物α-SMA以及 AGEs特異性受體RAGE較空白對照組表達上調（P<0.05），并且具有濃度依賴性。
　　2.分

6、別低劑量（10nmol/L）和高劑量（100nmol/L）骨化三醇處理NRK52E細胞24h后，上皮標志物E-cadherin，間質標志物α-SMA表達并未有明顯改變.
　　3.Western blot、熒光定量PCR、免疫熒光都觀察到一致結果，即：較空白對照組，AGEs組的E-cadherin顯著下調（P<0.05），α-SMA顯著上調（P<0.05），其結果能夠被骨化三醇所逆轉（P<0.05），高濃度較低劑量骨化三醇逆轉程度高

7、。AGEs組的RAGE、NF-κB磷酸化水平明顯上調（P<0.05），但能被被骨化三醇所逆轉（P<0.05），高濃度較低劑量骨化三醇逆轉程度高。普通顯微鏡下，空白對照組的細胞形態(tài)呈多邊形，AGEs組細胞形態(tài)呈梭形，骨化三醇+AGEs恢復到多邊形形態(tài)。
　　4.預先阻斷RAGE，可扭轉AGEs誘導的E-cadherin的顯著下調以及α-SMA表達的顯著上調（P<0.05）。
　　5.RAGE的表達在AGEs較空白對照組顯著上調

8、（P<0.05），100nmol/L骨化三醇預處理+AGEs組較AGEs組，RAGE和上調水平下降（P<0.05），但較100nmol/L骨化三醇預處理+AGEs組，100nmol/L骨化三醇＋IMD0354預處理+AGEs組，RAGE顯著上調（P<0.05）。
　　結論：
　　1、用AGEs成功構建NRK52E細胞的上皮間充質轉化模型。
　　2、單獨用骨化三醇刺激細胞，并未骨化三醇處理細胞并不能影響細胞的標志物表達水

9、平的改變。
　　3、骨化三醇可逆轉AGEs誘導的細胞的EMT，并且可能是通過逆轉AGEs誘導的RAGE、NF-κB磷酸化水平實現(xiàn)的。
　　4、阻斷RAGE，可阻斷AGEs引起的細胞的EMT，說明AGEs誘導細胞的EMT是通過RAGE實現(xiàn)的。
　　5、骨化三醇可降低RAGE的表達和NF-κB磷酸化水平，預先用NF-κB磷酸化抑制劑處理，可削弱骨化三醇對RAGE的降低水平。說明骨化三醇對RAGE水平的降低是部分通過NF-κ