蚯蚓蛋白對(duì)燙傷作用的研究.pdf

1、蚯蚓（EisemiaFoetida）又稱地龍、曲蟮，環(huán)節(jié)動(dòng)物門寡毛綱陸生動(dòng)物。我國(guó)對(duì)蚯蚓的藥用歷史悠久，是一種傳統(tǒng)的中藥。全世界已知的蚯蚓種類有3000多種，分為水棲種類、陸棲種類以及少數(shù)寄生，可供養(yǎng)殖的陸棲蚯蚓種類只有十幾種。
　　 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展關(guān)于蚯蚓的藥理活性的研究也越來越多，但是主要還是集中在其纖溶活性方面，關(guān)于其他的藥理活性的研究還很少，將提純后的蚯蚓蛋白制成外用凝膠劑用于燙傷治療的研究就更少了，而能查到的蚯

2、蚓治療燙傷的資料也主要是停留在對(duì)蚯蚓未分離純化的混合物的研究。民間中醫(yī)使用蚯蚓搗爛外敷治療燒燙傷效果顯著，為了尋找蚯蚓中治療燙傷的有效成分，本論文對(duì)蚯蚓蛋白進(jìn)行了分離純化，得到了一種對(duì)大鼠深I(lǐng)I度燙傷具有良好的促進(jìn)愈合效果的蛋白組分EFP-2-2，并對(duì)其可能的促進(jìn)愈合作用的機(jī)理進(jìn)行了研究。論文主要內(nèi)容如下：
　　 1.蚯蚓蛋白的分離提取。將鮮活蚯蚓冰浴勻漿，硫酸銨鹽析，透析48h后凍干即得蚯蚓粗蛋白EFP，得率為13.4％。對(duì)蚯

3、蚓粗蛋白EFP進(jìn)一步分離純化及活性組分篩選。采用NIH3T3成纖維細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，以促進(jìn)其增殖為主要指標(biāo)，通過逐級(jí)分離純化與促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，篩選得到生物活性強(qiáng)的蚯蚓蛋白EFP-2-2，確定了EFP-2-2的分離純化條件：蚯蚓粗蛋白凍干粉加水溶解，通過DEAESepharoseFastFlow離子柱，20mmol/L，pH7.8的磷酸鹽緩沖液洗脫兩個(gè)柱體積，然后用2mol/L氯化鈉溶液進(jìn)行線性洗脫，紫外檢測(cè)器28

4、0nm檢測(cè)到4個(gè)峰，收集活性高的第二個(gè)峰(EFP-2)濃縮并冷凍干燥；EFP-2加水溶解，通過superdex75凝膠柱，蒸餾水洗脫，紫外檢測(cè)器280nm檢測(cè)得到2個(gè)峰，收集活性高的第二個(gè)峰，透析（截留分子量3500）除鹽，濃縮并冷凍干燥得蚯蚓活性蛋白EFP-2-2。
　　 2.蚯蚓蛋白EFP-2-2對(duì)NIH3T3細(xì)胞的作用研究。選取燙傷愈合中的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞NIH3T3成纖維細(xì)胞為研究對(duì)象，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率結(jié)果表明，EFP-2

5、-2在高劑量(10ug/ml)時(shí)促進(jìn)增殖作用最好，與模型組比較細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且此增殖作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；NIH3T3細(xì)胞的劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析表明，給藥48h后不同濃度的EFP-2-2都有促進(jìn)NIH3T3細(xì)胞劃痕創(chuàng)面愈合的作用，且EFP-2-2在高劑量組(10ug/ml)時(shí)這種促進(jìn)劃痕創(chuàng)面愈合的作用最好，其給藥48h后劃痕創(chuàng)面已經(jīng)基本愈合；羥脯氨酸測(cè)定結(jié)果表明不同濃度的蚯蚓蛋白都有增加培養(yǎng)基中羥脯氨酸含量的作用，且EFP-2

6、-2在高劑量組(10ug/ml)時(shí)的這種促進(jìn)作用最好，其統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果與模型組比較具有顯著差異(P<0.01)。
　　 3.凝膠劑的制備及性質(zhì)考察。本實(shí)驗(yàn)選擇卡波姆-940為凝膠基質(zhì)，甘油、丙二醇為保濕劑，尼泊金乙酯為防腐劑，三乙醇胺為pH調(diào)節(jié)劑，選擇將卡波姆-940自然溶脹的方法制成卡波姆溶液，再加入pH調(diào)節(jié)劑制成凝膠劑。實(shí)驗(yàn)制成的凝膠劑外觀均勻、無色透明，兼具水化吸收雙重功效，高溫低溫下物理化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以進(jìn)行高溫高壓蒸汽滅菌

7、而外觀、性質(zhì)不發(fā)生變化，是非常理想的外用創(chuàng)傷敷料。
　　 4.蚯蚓蛋白EFP-2-2對(duì)大鼠深I(lǐng)I度燙傷的促進(jìn)愈合作用。實(shí)驗(yàn)將蚯蚓蛋白EFP-2-2加入到凝膠劑中制成蚯蚓蛋白外用凝膠劑，探討其對(duì)大鼠深I(lǐng)I度燙傷的促進(jìn)愈合作用。生化指標(biāo)和形態(tài)學(xué)結(jié)果表明：對(duì)燙傷愈合率和燙傷愈合時(shí)間進(jìn)行分析，我們發(fā)現(xiàn)高劑量組的EFP-2-2能夠明顯地提高燙傷愈合率和縮短燙傷愈合時(shí)間：對(duì)早期創(chuàng)面含水量進(jìn)行分析表明EFP-2-2能夠明顯減少創(chuàng)面早期水腫；M

8、asson三色染色法結(jié)果表明EFP-2-2組未變性的藍(lán)色區(qū)域明顯多于模型組，具有減少早期創(chuàng)面膠原變性的作用；羥脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果表明，EFP-2-2可以增加創(chuàng)面羥脯氨酸含量。
　　 5.蚯蚓蛋白EFP-2-2的初步結(jié)構(gòu)研究?？捡R斯亮藍(lán)法測(cè)定蚯蚓蛋白EFP-2-2的蛋白含量為61.25％;紫外-可見光譜發(fā)現(xiàn)蚯蚓蛋白EFP-2-2在210nm和280hm波長(zhǎng)有較強(qiáng)的紫外吸收；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)所分離得到的蛋白共有兩個(gè)蛋白

9、泳帶，進(jìn)一步采用凝膠定量軟件QuantityOne對(duì)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分子量預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)我們分離的兩種蛋白分子量分別是22.31KDa、18.01KDa。
　　 本課題通過逐級(jí)分離純化與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，得到生物活性強(qiáng)的蚯蚓蛋白EFP-2-2，并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了初步的分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明EFP-2-2具有促進(jìn)大鼠深I(lǐng)I度燙傷愈合作用，且對(duì)NIH3T3細(xì)胞具有明顯的促增殖作用。本實(shí)驗(yàn)從蚯蚓中發(fā)掘出具有促進(jìn)燙傷愈合的蛋白成分