蚯蚓蛋白對燙傷作用的研究.pdf

1、蚯蚓（EisemiaFoetida）又稱地龍、曲蟮，環(huán)節(jié)動物門寡毛綱陸生動物。我國對蚯蚓的藥用歷史悠久，是一種傳統(tǒng)的中藥。全世界已知的蚯蚓種類有3000多種，分為水棲種類、陸棲種類以及少數(shù)寄生，可供養(yǎng)殖的陸棲蚯蚓種類只有十幾種。
　　 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展關(guān)于蚯蚓的藥理活性的研究也越來越多，但是主要還是集中在其纖溶活性方面，關(guān)于其他的藥理活性的研究還很少，將提純后的蚯蚓蛋白制成外用凝膠劑用于燙傷治療的研究就更少了，而能查到的蚯

2、蚓治療燙傷的資料也主要是停留在對蚯蚓未分離純化的混合物的研究。民間中醫(yī)使用蚯蚓搗爛外敷治療燒燙傷效果顯著，為了尋找蚯蚓中治療燙傷的有效成分，本論文對蚯蚓蛋白進行了分離純化，得到了一種對大鼠深I(lǐng)I度燙傷具有良好的促進愈合效果的蛋白組分EFP-2-2，并對其可能的促進愈合作用的機理進行了研究。論文主要內(nèi)容如下：
　　 1.蚯蚓蛋白的分離提取。將鮮活蚯蚓冰浴勻漿，硫酸銨鹽析，透析48h后凍干即得蚯蚓粗蛋白EFP，得率為13.4％。對蚯

3、蚓粗蛋白EFP進一步分離純化及活性組分篩選。采用NIH3T3成纖維細胞為實驗材料，以促進其增殖為主要指標，通過逐級分離純化與促進NIH3T3細胞增殖實驗相結(jié)合的方法，篩選得到生物活性強的蚯蚓蛋白EFP-2-2，確定了EFP-2-2的分離純化條件：蚯蚓粗蛋白凍干粉加水溶解，通過DEAESepharoseFastFlow離子柱，20mmol/L，pH7.8的磷酸鹽緩沖液洗脫兩個柱體積，然后用2mol/L氯化鈉溶液進行線性洗脫，紫外檢測器28

4、0nm檢測到4個峰，收集活性高的第二個峰(EFP-2)濃縮并冷凍干燥；EFP-2加水溶解，通過superdex75凝膠柱，蒸餾水洗脫，紫外檢測器280nm檢測得到2個峰，收集活性高的第二個峰，透析（截留分子量3500）除鹽，濃縮并冷凍干燥得蚯蚓活性蛋白EFP-2-2。
　　 2.蚯蚓蛋白EFP-2-2對NIH3T3細胞的作用研究。選取燙傷愈合中的優(yōu)勢細胞NIH3T3成纖維細胞為研究對象，MTT法檢測細胞增殖率結(jié)果表明，EFP-2

5、-2在高劑量(10ug/ml)時促進增殖作用最好，與模型組比較細胞數(shù)量明顯增多，且此增殖作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性；NIH3T3細胞的劃痕愈合實驗結(jié)果分析表明，給藥48h后不同濃度的EFP-2-2都有促進NIH3T3細胞劃痕創(chuàng)面愈合的作用，且EFP-2-2在高劑量組(10ug/ml)時這種促進劃痕創(chuàng)面愈合的作用最好，其給藥48h后劃痕創(chuàng)面已經(jīng)基本愈合；羥脯氨酸測定結(jié)果表明不同濃度的蚯蚓蛋白都有增加培養(yǎng)基中羥脯氨酸含量的作用，且EFP-2

6、-2在高劑量組(10ug/ml)時的這種促進作用最好，其統(tǒng)計學結(jié)果與模型組比較具有顯著差異(P<0.01)。
　　 3.凝膠劑的制備及性質(zhì)考察。本實驗選擇卡波姆-940為凝膠基質(zhì)，甘油、丙二醇為保濕劑，尼泊金乙酯為防腐劑，三乙醇胺為pH調(diào)節(jié)劑，選擇將卡波姆-940自然溶脹的方法制成卡波姆溶液，再加入pH調(diào)節(jié)劑制成凝膠劑。實驗制成的凝膠劑外觀均勻、無色透明，兼具水化吸收雙重功效，高溫低溫下物理化學性質(zhì)穩(wěn)定，可以進行高溫高壓蒸汽滅菌

7、而外觀、性質(zhì)不發(fā)生變化，是非常理想的外用創(chuàng)傷敷料。
　　 4.蚯蚓蛋白EFP-2-2對大鼠深I(lǐng)I度燙傷的促進愈合作用。實驗將蚯蚓蛋白EFP-2-2加入到凝膠劑中制成蚯蚓蛋白外用凝膠劑，探討其對大鼠深I(lǐng)I度燙傷的促進愈合作用。生化指標和形態(tài)學結(jié)果表明：對燙傷愈合率和燙傷愈合時間進行分析，我們發(fā)現(xiàn)高劑量組的EFP-2-2能夠明顯地提高燙傷愈合率和縮短燙傷愈合時間：對早期創(chuàng)面含水量進行分析表明EFP-2-2能夠明顯減少創(chuàng)面早期水腫；M

8、asson三色染色法結(jié)果表明EFP-2-2組未變性的藍色區(qū)域明顯多于模型組，具有減少早期創(chuàng)面膠原變性的作用；羥脯氨酸含量測定結(jié)果表明，EFP-2-2可以增加創(chuàng)面羥脯氨酸含量。
　　 5.蚯蚓蛋白EFP-2-2的初步結(jié)構(gòu)研究?？捡R斯亮藍法測定蚯蚓蛋白EFP-2-2的蛋白含量為61.25％;紫外-可見光譜發(fā)現(xiàn)蚯蚓蛋白EFP-2-2在210nm和280hm波長有較強的紫外吸收；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)所分離得到的蛋白共有兩個蛋白

9、泳帶，進一步采用凝膠定量軟件QuantityOne對SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分子量預測發(fā)現(xiàn)我們分離的兩種蛋白分子量分別是22.31KDa、18.01KDa。
　　 本課題通過逐級分離純化與細胞實驗相結(jié)合的方法，得到生物活性強的蚯蚓蛋白EFP-2-2，并對其性質(zhì)進行了初步的分析。實驗結(jié)果表明EFP-2-2具有促進大鼠深I(lǐng)I度燙傷愈合作用，且對NIH3T3細胞具有明顯的促增殖作用。本實驗從蚯蚓中發(fā)掘出具有促進燙傷愈合的蛋白成分