MG53對重度燙傷小鼠腎臟保護(hù)作用的研究.pdf

1、內(nèi)臟器官是機(jī)體各項生命活動的參與者和維持者。嚴(yán)重?zé)齻?，急性的缺血缺氧、炎癥因子等因素，都會造成機(jī)體內(nèi)臟器官的損傷。內(nèi)臟器官受損，特別是多臟器功能損傷是燒傷病情加重、并發(fā)癥發(fā)生以及死亡率增加的重要特征。加強(qiáng)重要內(nèi)臟損傷的防治和促進(jìn)受損臟器早日修復(fù)與重建是提高救治成功率和大幅度降低死亡率的關(guān)鍵。嚴(yán)重?zé)齻?，由于臟器本身存在肉眼難辨的缺血性損害，加之這類損傷范圍廣，累計器官多，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、隱蔽以及缺乏有效的促修復(fù)措施，因而其損傷后的修復(fù)常

2、不易引起人們的重視[1]。既往采取的各種措施，常常僅是針對發(fā)病機(jī)制的某一環(huán)節(jié)或減輕其損害程度，并不直接作用于修復(fù)細(xì)胞本身，故缺乏對臟器的主動修復(fù)。因此，如何加速與促進(jìn)受損內(nèi)臟細(xì)胞的主動修復(fù)有可能為防治多器官功能障礙綜合癥(multipleorgandysfunctionsyndrome，MODS)、多臟器功能衰竭(multiplesystemorganfailure，MSOF)發(fā)生以及提高救治成功率提供新的有效途徑，具體重要的理論意義和

3、臨床應(yīng)用價值。
　　MG53(Mitsugumin53)，一個肌肉特有的TRIM家族蛋白，是細(xì)胞膜損傷修復(fù)的一個必不可少的組分。Ma等的研究表明，重組的人MG53(RecombinantHumanMitsugumin53，rhMG53)能夠治療肌營養(yǎng)不良癥以及以細(xì)胞膜損傷為發(fā)病機(jī)理的其他人類疾病。當(dāng)培養(yǎng)肌肉和非肌肉細(xì)胞的培養(yǎng)液中存在rhMG53時，rhMG53能夠識別細(xì)胞膜損傷信號，進(jìn)而提高這些細(xì)胞的膜修復(fù)能力。小鼠動物實驗研究表

4、明，通過各種途徑（肌內(nèi)、靜脈、皮下）給予rhMG53，都能夠提高骨骼肌細(xì)胞膜修復(fù)能力，同樣也能一定程度上改善肌營養(yǎng)不良癥的組織病理變化[2]。
　　因此我們推測，機(jī)體嚴(yán)重燙傷后，通過外源性的rhMG53治療，可能對燙傷造成的各種臟器損傷起到一定的修復(fù)作用，改善臟器功能，提高生存率。本研究以30％的Ⅲ度燙傷小鼠為模型，觀察靜脈注射rhMG53對重度燒傷小鼠生存率和臟器組織的保護(hù)作用的影響，及其可能的機(jī)制。
　　研究內(nèi)容和方法:

5、
　　1.MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及臟器病理改變的實驗研究
　　1)小鼠Ⅲ°燒傷模型的制作
　　使用YLS-Q5超級臺式溫控燙傷儀致傷Balb/c小鼠，通過溫度和時間兩個因素控制燙傷深度。使用致傷溫度為90℃，自重500g，燙頭直接2cm恒溫金屬燙頭垂直接觸小鼠皮膚6s，8s，10s，經(jīng)HE染色觀察燒傷皮膚組織學(xué)改變，確定小鼠Ⅲ°燒傷模型的制作條件。
　　2)MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及

6、臟器病理改變的研究
　　實驗前分裝外源性rhMG53蛋白。16只20g左右的雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分兩組，為MG53實驗組及BSA對照組，分別制作30％Ⅲ°燙傷面積，傷后予以腹腔注射2.5ml乳酸鈉林格注射液，燙傷后0.5h，燙傷后6.5h，分別通過尾靜脈注射外源性rhMG53蛋白及BSA蛋白，傷后每6小時記錄小鼠死亡數(shù)目至傷后48小時，統(tǒng)計死亡率。傷后48小時存活的小鼠心臟灌注，取小鼠的心，肝，脾，肺，腎，小腸，結(jié)腸，腦，肌

7、肉，皮膚，胃組織，4％多聚甲醛固定，24h組織脫水，石蠟包埋、切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察各組組織損傷情況。
　　3)重度燙傷小鼠腎臟損傷的評估
　?、僦囟葼C傷小鼠腎小管壞死程度的評分
　　隨機(jī)選取每只小鼠腎臟切片一張，并在顯微鏡下隨機(jī)選取20個視野觀察，根據(jù)腎小管的壞死程度，采用Erdogan等的半定量病理評估法評分:評分越高說明腎小管壞死越嚴(yán)重，0分:正常腎臟;1分:最少壞死（＜5％腎小管壞死）;

8、2分:輕度壞死(5％～25％腎小管壞死);3分:中度壞死（25％～75％腎小管壞死）;4分:重度壞死（＞75％的腎小管壞死）。分析的實驗結(jié)果以(x±s）表示，采用MicrosoftExcel軟件及SPSS13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　②免疫組織化學(xué)SP法檢測重度燙傷小鼠腎臟中KIM-1的表達(dá)
　　取前面實驗小鼠的腎臟石蠟切片，分MG53實驗組及BSA對照組，每組選取4張切片，使用腎損傷分子

9、-1(KidneyInjuryMolecule-1，KIM-1)多克隆抗體行免疫組化(IHC)染色，顯微鏡下觀察各組腎臟中KIM-1的表達(dá)情況;每張切片隨機(jī)選取5個視野，顯微鏡下拍照，拍照后，IPP軟件半定量分析，分析的實驗結(jié)果以(x±s）表示，采用MicrosoftExcel軟件及SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2.通過尾靜脈注射的外源性rhMG53蛋白在體內(nèi)的分布及

10、重度燙傷后PTRF體內(nèi)表達(dá)的變化
　　1)免疫組化方法檢測外源性rhMG53蛋白在小鼠體內(nèi)的分布
　　取前面實驗小鼠臟器的石蠟切片，使用MG53多克隆抗體，分別進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，以心肌及骨骼肌表達(dá)內(nèi)源性MG53組織作陽性對照，觀察其他臟器中外源性rhMG53分分布，顯微鏡下觀察，拍照。
　　2)免疫組化方法檢測正常小鼠及重度燙傷小鼠體內(nèi)的PTRF的表達(dá)
　　取正常小鼠及重度燙傷小鼠腎臟的石蠟切片，使用PTRF

11、多克隆抗體，分別進(jìn)行免疫組化，觀察重度燙傷后，小鼠體內(nèi)PTRF表達(dá)的變化，顯微鏡下拍照，拍照后，IPP軟件半定量分析，分析的實驗結(jié)果以(x±s）表示，采用MicrosoftExcel軟件及SPSS13.0統(tǒng)計軟件中的獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;繼續(xù)取重度燙傷小鼠小腸及皮膚石蠟切片，性免疫組化染色，觀察PTRF的表達(dá)情況。
　　實驗結(jié)果:
　　1.MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及臟器病理

12、改變的實驗研究
　　1)小鼠Ⅲ°燒傷模型的制作
　　在自然狀態(tài)下，使用燙頭直接接觸小鼠皮膚8s，壓力為500g，燙頭溫度為90℃時，組織學(xué)顯示皮膚各層、皮下附件及皮下脂肪組織均發(fā)生凝固性壞死，無完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，真皮內(nèi)膠原腫脹變形，符合Ⅲ°燒傷組織學(xué)改變。
　　2)MG53對30％Ⅲ°燙傷小鼠死亡率影響及臟器病理改變的研究
　　MG53給藥組傷后48h的死亡率為25％，BSA組傷后48h的死亡率為37.5％，MG5

13、3給藥組死亡率低于BSA對照組，但統(tǒng)計學(xué)Kaplan-Meier分析，P值＞0.05，無統(tǒng)計學(xué)差異;HE染色結(jié)果顯示，嚴(yán)重?zé)齻笮∈蟮男?、肝、脾、肺、胃、小腸、結(jié)腸、皮膚、肌肉、腦組織等臟器均有不同程度的組織學(xué)變化，但MG53給藥組和BSA對照組在上述多數(shù)組織中無明顯的差別，有明顯差別的臟器是腎臟。組織切片顯示MG53給藥組的腎臟近曲小管和遠(yuǎn)曲小管上皮細(xì)胞濁腫變性、壞死脫落以及腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤方面較對照組有明顯改善，腎小球無明顯變化。

14、
　　3)重度燙傷小鼠腎臟損傷的評估
　?、僦囟葼C傷小鼠腎小管壞死程度的評分
　　MG53給藥組的Erdogan半定量病理評分顯著低于BSA對照組腎小管病理損傷評分(P＜0.0001)。
　?、诿庖呓M織化學(xué)SP法檢測重度燙傷小鼠腎臟中KIM-1的表達(dá)
　　各組腎臟KIM-1免疫組化結(jié)果顯示:腎皮質(zhì)髓質(zhì)的損傷部位均可見KIM-1的表達(dá)，且表達(dá)量隨腎臟損傷范圍及程度的增加而成明顯升高趨勢。顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，

15、MG53給藥組小鼠腎臟的KIM-1表達(dá)明顯弱于BSA對照組，而在用PBS代替一抗的損傷腎臟中，沒有發(fā)現(xiàn)陽性染色;通過IPP軟件分析各組小鼠KIM-1表達(dá)的平均光密度顯示，MG53給藥組平均光密度OD值顯著低于BSA對照組，差異有明顯的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.0001)。
　　2.通過尾靜脈注射的外源性rhMG53蛋白在體內(nèi)的分布及重度燙傷后PTRF體內(nèi)表達(dá)的變化
　　1)免疫組化方法檢測外源性rhMG53蛋白在小鼠體內(nèi)的分布

16、r>　　免疫組化結(jié)果顯示，沒有給予rhMG53的小鼠體內(nèi)，內(nèi)源性MG53主要分布在心肌和骨骼肌，可見骨骼肌細(xì)胞胞漿和心肌細(xì)胞呈強(qiáng)陽性染色。除心肌和骨骼肌外，其它組織均為陰性。在rhMG53給藥組，小鼠的rhMG53主要分布于部分腎皮質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞和部分腎髓質(zhì)腎小管上皮細(xì)胞，并且強(qiáng)陽性染色主要集中于損傷嚴(yán)重的區(qū)域，而對照組在這些部位未見陽性細(xì)胞。另外MG53實驗組小鼠的肺臟中，發(fā)現(xiàn)大量rhMG53的分布，且rhMG53主要分布于肺臟部分

17、小靜脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，而其他組織中未見明顯陽性細(xì)胞。
　　2)免疫組化方法檢測正常小鼠及重度燙傷小鼠體內(nèi)的PTRF的表達(dá)
　　腎臟PTRF免疫組化結(jié)果顯示:正常小鼠腎臟和重度燙傷小鼠腎臟，皆可見大量的強(qiáng)陽性染色，且在腎臟的皮質(zhì)和髓質(zhì)都存在大量的強(qiáng)陽性區(qū)域。顯微鏡下初步觀察結(jié)果顯示，兩組腎臟PTRF的表達(dá)無明顯差別，而在用PBS代替一抗的腎臟中，沒有發(fā)現(xiàn)陽性染色;通過IPP軟件分析各組小鼠PTRF表達(dá)的平均光密度OD值，結(jié)果顯

18、示，正常小鼠腎臟平均光密度OD值與重度燙傷小鼠相比，無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.890);另外小鼠的小腸及皮膚中，皆有PTRF的弱陽性表達(dá)，較腎臟相比較，陽性區(qū)域的面積及染色強(qiáng)度明顯較弱。
　　實驗結(jié)論:動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，尾靜脈注射rhMG53蛋白能夠選擇性到達(dá)PTRF的高表達(dá)的腎臟。尾靜脈注射rhMG53蛋白能夠降低30％Ⅲ°燙傷小鼠早期死亡的發(fā)生，并改善腎臟的病理損傷情況。上述研究提示，嚴(yán)重?zé)齻笸庠葱詒hMG53蛋白能夠通過