蚯蚓活性蛋白促進成纖維細胞增殖的作用及信號通路研究.pdf

1、成纖維細胞是創(chuàng)傷愈合過程中對組織再生、修復和重建功能至關重要的細胞，能夠分泌膠原等細胞外基質成分和多種生長因子，促進傷口愈合。近年來，蚯蚓作為中國傳統(tǒng)中藥，普遍用于祛瘀和刺激傷口愈合等藥理活性的研究，且有很多研究結果表明蚯蚓提取物能夠促進創(chuàng)面愈合。然而，蚯蚓是如何作用于創(chuàng)面并促進組織存活的尚未知。本課題是以從鮮蚯蚓為原料，針對其促增殖作用進行工藝優(yōu)化得到的蚯蚓活性蛋白(EAP)，研究EAP對小鼠胚胎成纖維細胞NIH/3T3細胞的活性作用

2、，并探討EAP促進NIH3T3細胞增殖的信號通路。研究內容及結果如下:
　　 1、蚯蚓蛋白提取工藝的優(yōu)化及分離純化。
　　 結合實驗室前期研究，首先以MTT活性篩選方法，著重考察了鹽析條件和脫鹽條件對蚯蚓蛋白提取物活性的影響，并通過正交設計考察溶劑、溫度、鹽飽和度對蚯蚓粗蛋白活性的影響，確定了最優(yōu)的提取工藝，即鮮蚯蚓加入兩倍量的pH7.8的磷酸鹽緩沖液冰浴勻漿，4℃靜置4h，離心25min，取上清鹽析至50％飽和度，4℃

3、靜置1h，離心25min，上清液用0.2μm的中空纖維膜組件超濾的方式除去大分子，然后用截留分子量為20k-50k中空纖維膜組件超濾的方式除鹽。后面按照分離純化流程，經過DEAE離子交換層析、S200凝膠柱層析和TSK高效凝膠層析得到EAP。
　　 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析得到的EAP為較單一的電泳純蛋白，其分子量為58.84kDa，苯酚硫酸法測定糖含量為13.77％，雙向電泳測定蛋白等電點為4左右，HPLC-ELSD分析

4、含有11種已知氨基酸和多種未知成分。
　　 2、蚯蚓蛋白對NIH3T3細胞增殖和遷移的作用
　　 通過MTT活性檢測和Brdu摻入方法檢測不同濃度EAP對NIH3T3細胞增殖的影響，結果說明EAP能夠以劑量依賴的方式促進NIH3T3成纖維細胞DNA的復制，促進其增殖;流式細胞術檢測細胞周期結果說明，EAP能夠以劑量依賴的促進NIH3T3細胞從G1期向S期轉變，顯著提高S期細胞比例;Western Blotting檢測調控

5、G1/S期檢驗點的CyclinD1蛋白表達，結果顯示EAP作用后，CyclinD1表達水平有顯著性提高。細胞劃痕實驗和Transwell小室的結果共同說明，EAP具有促進NIH3T3細胞遷移的活性，且其促細胞遷移作用具有劑量依賴性。
　　 3、EAP促進細胞增殖的具體信號通路及對細胞周期的影響。
　　 首先選用不同的信號通路抑制劑，分別研究了EAP促進細胞增殖作用過程中不同信號通路的參與情況。MTT和Western bl

6、otting結果顯示，MEK抑制劑PD98059和U0126預處理均可以顯著抑制細胞增殖作用，并明顯阻斷EAP激活的ERK磷酸化。流式細胞術和Western blotting分別檢測加入U0126后細胞周期和Cyclin D1蛋白表達水平，結果表明U0126可顯著阻斷細胞周期進程和Cyclin D1蛋白的表達水平。
　　 然后采用MTT法檢測B-Raf和Raf-1抑制劑預處理對細胞增殖無明顯影響。接下來，MTT和Western

7、blotting結果顯示PI3K抑制劑LY294002預處理可顯著抑制EAP引起的細胞增殖，且抑制了Akt和ERK磷酸化水平升高，提示PI3K也參與了EAP促進NIH3T3細胞增殖的過程。
　　 綜上，推斷EAP促進NIH3T3細胞增殖的作用機制為:EAP通過激活MEK/ERK信號通路，引起CyclinD1蛋白表達升高，促進細胞周期從G1期進入S期，最終引起細胞增殖，且PI3K信號通路可能是ERK的上游，通過PI3K→Rac→P