Neuroleukin在關(guān)節(jié)軟骨的表達(dá)及其對軟骨細(xì)胞增殖和基質(zhì)分泌影響的研究.pdf

1、關(guān)節(jié)軟骨是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成的無血管組織，由于沒有血供，自身修復(fù)能力較差，關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)一直是關(guān)節(jié)外科的治療難題。盡管用于臨床治療軟骨缺損的手段很多，但是遠(yuǎn)期效果都不很理想，而且關(guān)節(jié)軟骨的增殖能力差，長期的體外培養(yǎng)擴(kuò)增時間均導(dǎo)致了軟骨細(xì)胞的體外去分化，從而形成無功能性的纖維軟骨，大大影響了組織工程軟骨的修復(fù)效果。Neuroleukin是一種神經(jīng)生長因子，也是一種自分泌運動因子(Autocrine motility facto

2、r AMF)，雖然Neuroleukin/AMF在血管內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞僅有少量研究，但是目前普遍認(rèn)為Neuroleukin/AMF是一種腫瘤細(xì)胞所特異性分泌，并與腫瘤的侵襲，轉(zhuǎn)移，增殖和血管生成相關(guān)的多功能蛋白，它同時也作為（Glucose-6-phosphate isomerase GPI）存在于細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝。大量研究證明Neuroleukin的這種功能都是通過他的胞膜受體AMFR來介導(dǎo)實現(xiàn)的。然而NLK作為一種多功能蛋白

3、，其在軟骨細(xì)胞的功能卻沒有報道。在本研究中，我們探究并證實了AMFR和Neuroleukin在軟骨細(xì)胞的表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)Neuroleukin/AMFR表達(dá)和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞成熟和分化的有關(guān);并且發(fā)現(xiàn)NLK能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖以及Ⅱ型膠原分泌，另外，信號通路的檢測證明NLK對軟骨細(xì)胞的這些作用很可能是通過PI3K和Smads通路介導(dǎo)的。
　　本研究中我們首次發(fā)現(xiàn)了Neuroleukin作為一種生理性細(xì)胞因子存在并被軟骨細(xì)胞分泌，發(fā)現(xiàn)N

4、LK的表達(dá)和軟骨細(xì)胞的分化，成熟有關(guān);而且能夠作為細(xì)胞外因子通過其胞膜受體AMFR在軟骨細(xì)胞上也能夠行使其促進(jìn)增殖和分泌基質(zhì)的功能;我們的結(jié)果表明Neuroleukin可能用于自體軟骨移植ACI的輔助治療或者細(xì)胞注射等治療手段，可能為軟骨組織工程帶來新的治療途徑。
　　實驗一 Neuroleukin及其受體在關(guān)節(jié)軟骨的表達(dá)
　　目的:研究Neuroleukin和其受體AMFR/gp78在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表達(dá)。
　　方法:

5、選擇1月齡大鼠軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)，利用Western blot檢測并且以腫瘤細(xì)胞系(B16-F1，HT1080)和血管內(nèi)皮細(xì)胞系，成纖維細(xì)胞系(HUVEC，NIH3T3)作為對照探究NLK在軟骨細(xì)是否存在，檢測正常軟骨細(xì)胞能否分泌NLK;利用免疫組化方法和免疫熒光/激光共聚焦觀察AMFR在細(xì)胞膜的表達(dá)情況，分析不同月齡大鼠的關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)NLK和AMFR的表達(dá)差異。
　　結(jié)果:Western blot表明NLK生理性存在于軟骨細(xì)胞，

6、而且NLK/AMFR在腫瘤細(xì)胞相對于正常細(xì)胞呈現(xiàn)明顯高表達(dá);免疫組化表明AMFR存在于軟骨細(xì)胞膜，并且表層關(guān)節(jié)軟骨的表達(dá)遠(yuǎn)高于肥大軟骨細(xì)胞的表達(dá);Western blot同樣證明NLK不僅能夠被腫瘤細(xì)胞分泌，也能夠被軟骨細(xì)胞生理性分泌;NLK/AMFR的表達(dá)量在1周-4月大鼠關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育期逐漸增高，而在4月-12月隨著關(guān)節(jié)的成熟和老化退變，其表達(dá)量逐漸下降。
　　結(jié)論:Neuroleukin作為一種生理性細(xì)胞因子存在并被關(guān)節(jié)軟骨細(xì)

7、胞分泌，其膜受體AMFR/gp78也被軟骨細(xì)胞表達(dá);NLK和其受體AMFR/gp78的表達(dá)量隨著幼齡大鼠關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育的成熟/老齡大鼠關(guān)節(jié)軟骨的老化退變而逐漸上升/下降。
　　實驗二 Neuroleukin對大鼠體外關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖能力的影響
　　目的:研究NLK對軟骨細(xì)胞增殖能力的影響和其機(jī)制。
　　方法:設(shè)計濃度梯度微流控芯片以觀察不同濃度NLK對軟骨細(xì)胞增殖能力的影響并探究最佳有限濃度，在6天的連續(xù)培養(yǎng)中觀察NLK

8、能否促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，并作NLK促增殖作用的最佳濃度篩選;觀察在NLK作用下連續(xù)培養(yǎng)6天后軟骨細(xì)胞的形態(tài)有無變化。進(jìn)行細(xì)胞周期分布檢測，檢測NLK對軟骨細(xì)胞周期分布的影響并分析;Western blot檢測NLK作用條件下AMFR的表達(dá)情況和PI3K-Akt，MAPK通路及其下游的周期蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:NLK能夠通過AMFR促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖，并且在NLK作用下連續(xù)培養(yǎng)6天后軟骨細(xì)胞的形態(tài)沒有明顯變化，NLK對軟骨細(xì)胞的促

9、增殖作用在一定濃度范圍內(nèi)有濃度依賴性升高，在12.85ng/ml時達(dá)到最佳有效濃度;NLK促進(jìn)增細(xì)胞周期中增殖軟骨細(xì)胞的比例，表現(xiàn)為NLK作用條件下S期，G2M期比例升高。NLK的作用明顯上調(diào)了其受體AMFR在軟骨細(xì)胞的表達(dá)水平，并且NLK通過提高Akt和ERK的磷酸化水平從而影響其下游細(xì)胞周期蛋白來促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:NLK能夠通過調(diào)控PI3K-Cyclin促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的體外增殖，NLK的增殖作用是通過NLK/AM

10、FR激活PI3K-Akt及其下游的cyclin蛋白實現(xiàn)的。
　　實驗三 Neuroleukin對大鼠體外關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)蛋白分泌的影響
　　目的:研究NLK對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)蛋白分泌的影響和其機(jī)制。
　　方法:設(shè)計引物通過Realtime PCR手段檢測軟骨細(xì)胞的特異性基質(zhì)Ⅱ膠原蛋白和蛋白多糖在48小時Neuroleukin作用下的mRNA表達(dá)水平的變化;并以低血清培養(yǎng)基組作為對照組，通過western blot和免疫

11、熒光檢測蛋白水平Ⅱ型膠原蛋白在NLK作用下48小時及P0-P1連續(xù)培養(yǎng)時的表達(dá);通過western blot及免疫熒光檢測p-Smad2/3和p-Smad1/5/8蛋白在Neuroleukin作用后的磷酸化水平的變化。
　　結(jié)果:Realtime PCR表明Neuroleukin48小時作用下，Ⅱ型膠原蛋白mRNA表達(dá)水平較對照組明顯升高，而蛋白多糖GAGs表達(dá)的mRNA水平無顯著變化;同樣NLK作用48小時Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)明顯升