miR-15a在人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡作用的研究.pdf

1、背景：
　　骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)退行性疾病,又稱骨關(guān)節(jié)病、退行性關(guān)節(jié)炎。其病情進(jìn)展與年齡相關(guān),發(fā)病緩慢,對(duì)中老年人群的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,是老年人致殘的重要因素。隨著我國(guó)老齡化進(jìn)程的加快,骨關(guān)節(jié)炎對(duì)家庭和全社會(huì)的影響和負(fù)擔(dān)日益突出。骨關(guān)節(jié)炎的病因復(fù)雜,其危險(xiǎn)因素包括年齡、體重、關(guān)節(jié)創(chuàng)傷等,目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制還缺乏較深入的了解,不能較完整地闡明其本質(zhì)。骨關(guān)節(jié)炎主要累及全身各活動(dòng)關(guān)節(jié),以髖關(guān)

2、節(jié)、膝關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)等負(fù)重關(guān)節(jié)最為多見(jiàn),其主要病理特征為受累關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)遭到破壞,病變涉及滑膜細(xì)胞、軟骨、軟骨下骨以及周圍肌肉韌帶等軟組織,最終導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)變形,關(guān)節(jié)功能障礙。
　　microRNA即微小RNA,是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA分子,進(jìn)化上高度保守,長(zhǎng)約17～25個(gè)核苷酸。microRNA廣泛存在于動(dòng)物植物體內(nèi),并能夠以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與其靶基因mRNA結(jié)合,進(jìn)而降解靶基因或者抑制

3、靶基因翻譯過(guò)程,起到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的作用,是體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的重要分子。大量研究表明,microRNA參與調(diào)控炎癥、腫瘤、生長(zhǎng)發(fā)育等多種病理及生理過(guò)程,與此同時(shí)其在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展及治療中所起到的作用值得我們進(jìn)一步深入了解。本實(shí)驗(yàn)以miR-15a為研究重點(diǎn),探索其是否對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病起到了調(diào)控作用。
　　目的：
　　1.驗(yàn)證miR-15a在正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的差異表達(dá);
　　2.明確miR-15a對(duì)

4、體外原代培養(yǎng)的人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖與凋亡的影響;
　　3.明確 miR-15a對(duì)Ⅱ型膠原等功能蛋白在軟骨細(xì)胞中表達(dá)的影響,初步闡釋miR-15a在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中起到的作用,為骨關(guān)節(jié)炎分子靶向治療提供潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.采用酶兩步消化法獲取并原代培養(yǎng)正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,細(xì)胞單層爬片后采用甲苯胺藍(lán)染色法、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色加以鑒定。
　　2.采用酶兩步消化法獲取并原代培養(yǎng)正常人膝關(guān)

5、節(jié)軟骨細(xì)胞與人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-15a在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量。
　　3.利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑將人工化學(xué)合成的miR-15a模擬物(mimics)、無(wú)關(guān)陰性對(duì)照序列(Negative Control)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-15a在各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的表達(dá)。
　　4.轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后,MTT比色法檢測(cè)miR-15a對(duì)軟骨細(xì)

6、胞增殖的影響。
　　5.轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-15a對(duì)軟骨細(xì)胞凋亡的影響。
　　6.轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后,Western blot檢測(cè)miR-15a對(duì)軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.采用酶兩步消化法獲得了原代人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色法、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定后,其純度及生物學(xué)活性符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　2.熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-1

7、5a在正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中的表達(dá)量,結(jié)果顯示 miR-15a在兩種軟骨細(xì)胞中差異表達(dá),并且在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)量明顯增高,P<0.05。
　　3.利用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑,成功將miR-15a模擬物轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞內(nèi),熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率大于90％,滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
　　4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后軟骨細(xì)胞增殖速率顯著降低,P<0.

8、05。
　　5.流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后軟骨細(xì)胞凋亡率顯著增高,P<0.05。
　　6.Western blot結(jié)果提示與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染miR-15a模擬物后軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)水平顯著降低,P<0.05。
　　結(jié)論：
　　1.采用酶兩步消化法可成功獲得原代正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與原代人骨關(guān)節(jié)炎膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,經(jīng)鑒定后細(xì)胞純度與所具有的功能表型可用于后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。
　

9、　2.miR-15a在正常人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞與人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中差異表達(dá),在正常關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中表達(dá)量顯著低于骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞。
　　3.化學(xué)合成的miR-15a模擬物可高效地轉(zhuǎn)染進(jìn)體外培養(yǎng)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,可在96h內(nèi)顯著提高細(xì)胞內(nèi)miR-15a的表達(dá)量。
　　4.miR-15a可抑制軟骨細(xì)胞增殖,促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡,提示miR-15a在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過(guò)程中扮演了重要的角色。
　　5.miR-15a可通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞中Ⅱ型