缺鋅對大鼠骺板軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：
　　 鋅是人體中200余種酶的組成成分,并是許多酶的催化劑,故能促進(jìn)DNA、蛋白質(zhì)、膠原的合成,促進(jìn)生長發(fā)育。鋅缺乏會使機(jī)體的代謝平衡受到破壞,從而影響其他營養(yǎng)素(包括微量元素)在機(jī)體中的作用,可使骨密度發(fā)生改變,引起骨生長遲緩,對少年兒童生長發(fā)育有嚴(yán)重的影響。近年來的研究表明,哺乳動物細(xì)胞內(nèi)有一類類似ATP酶的蛋白質(zhì)-鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(zinc transporters,ZnTs),可轉(zhuǎn)運(yùn)鋅離子,并調(diào)節(jié)質(zhì)膜內(nèi)外鋅離子濃度

2、。ZnT-1(鋅轉(zhuǎn)移蛋白1)是ZnTS家族中重要的組成部分,它定位于細(xì)胞膜表面上,將鋅離子從細(xì)胞外聚集到細(xì)胞體內(nèi),用于細(xì)胞內(nèi)各種含鋅蛋白的合成和加工,其中包括很多參與調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá)的DNA結(jié)合蛋白。本文從缺鋅狀態(tài)下骺板軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡入手,并探討缺鋅與ZnT-1表達(dá)的關(guān)系。
　　 材料與方法：
　　 1.大鼠生長板軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng):雄性vista大鼠,斷頸法處死,進(jìn)行軟骨細(xì)胞培養(yǎng)并進(jìn)行鑒定。
　　 2.細(xì)胞

3、缺鋅模型的制備:向無血清培養(yǎng)液內(nèi)加入不同濃度鋅螯合劑TPEN(5μM、10μM、20μM)作用24h,造成軟骨細(xì)胞鋅缺乏。
　　 3.MTT法檢測細(xì)胞增殖倍數(shù):將不同濃度的培養(yǎng)液加入96孔培養(yǎng)板中,加入培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞,同時設(shè)空白對照。培養(yǎng)24h后,每孔加入溴化二甲噻嘩二苯四氮唑(MIT),,繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后棄上清,加入鹽酸異丙醇充分溶解,測量570nm和630nm的OD值,通過曲線測得產(chǎn)物濃度,分析細(xì)胞增殖情況。
　　

4、 4.流式細(xì)胞學(xué)檢測凋亡:不含EDTA的胰酶常規(guī)消化細(xì)胞,PBS洗兩遍,加入200μl Binding buffer,重懸后加入10μl Annexin V反應(yīng)30 min,再加入5μlPI和300μl Binding buffer,混勻反應(yīng)5 min后上機(jī)檢測。
　　 5.定位、定量檢測ZnTl在對照組和實驗組大鼠骺板軟骨細(xì)胞的分布和變化。Real time-PCR和Western Blotting方法。
　　 6.統(tǒng)

5、計學(xué)分析實驗重復(fù)3次,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組對照采用t檢驗比較,三組以上采用方差分析比較實驗各組均數(shù)與對照組均數(shù)之間的差異,以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng):原代培養(yǎng)的生長板軟骨細(xì)胞中95％以上的細(xì)胞Ⅰ、Ⅱ型膠原陽性染色,細(xì)胞核周圍和細(xì)胞膜周邊都有Ⅱ型膠原的陽性染色,陽性染色的纖維包裹著細(xì)胞核,保持圓形的細(xì)胞呈強(qiáng)陽性染色。而X型膠原染色沒有陽性反應(yīng)。
　　 2.MTT

6、檢測結(jié)果:通過MTT檢測隨TPEN的濃度的增高,軟骨細(xì)胞后24h細(xì)胞相對存活率逐漸降低。
　　 3.流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果:用Annexin V PI染色,檢測7μ M TPEN處理細(xì)胞時細(xì)胞凋亡情況,可見細(xì)胞凋亡增加J下常組9.93％TPEN組94.78％。
　　 4.Western Blot:檢測ZnT-1表達(dá)變化,5μ mol/L(TPEN)組與對照組相比略有增高,而10μ mol/L、20μ mol/L組與對照組相比