關(guān)節(jié)軟骨細胞體外增殖及代謝規(guī)律的實驗研究.pdf

1、　　目的：本實驗為課題―雷公藤甲素對同種異體軟骨細胞移植免疫排斥反應(yīng)作用的實驗研究‖的前期實驗,目的是通過研究兔關(guān)節(jié)軟骨細胞體外二維及三維培養(yǎng)環(huán)境中增殖及代謝情況,為下一步動物實驗篩選出最合適的種子細胞及回植體內(nèi)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的最佳時間點。
　　方法：取2周齡青紫藍兔,耳緣靜脈空氣栓塞處死,立即刮除兩側(cè)髖、膝關(guān)節(jié)周圍兔毛,采用無菌手術(shù)方式切取兩側(cè)股骨頭和股骨髁,隨即浸泡于 PBS液中,并移至超凈臺,分離軟骨,用消毒好的剪刀將其

2、剪碎, II 型膠原酶消化獲取軟骨細胞；體外單層培養(yǎng)(不使用任何生長因子),長滿后傳代,倒置顯微鏡下觀察第1 代至第 5 代細胞形態(tài)的變化；樣品細胞進行臺盼藍染色,計數(shù)未著色細胞,求平均值,繪制每代細胞的生長曲線,判斷細胞的增殖能力；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：以青紫藍兔半月板來源的纖維軟骨細胞分別作為陽性對照和陰性對照,檢測各代細胞 I 型膠原和Ⅱ 型膠原在基因水平的表達；三維環(huán)境下,采用Hoechst33258 DNA定量法

3、測定細胞在PLGA中的生長增殖情況；GAG定量檢測來判斷軟骨細胞在支架材料上增殖和分化能力。
　　結(jié)果：貼壁的原代軟骨細胞呈橢圓形、多角形、多邊形,隨著培養(yǎng)時間的延長,軟骨細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,至第4代,細胞由多角形逐漸向梭形轉(zhuǎn)變,即向成纖維細胞樣轉(zhuǎn)化；至第5代,細胞以梭形為主,細胞間間隙增大,胞質(zhì)不清,內(nèi)可見空泡。細胞的增殖能力隨著傳代次數(shù)的增加而逐漸減小,秩和檢驗分析發(fā)現(xiàn)：原代及第1、2代細胞與第3、4代細胞生長曲線間有差異

4、( P﹤0.05),與第5代細胞存在顯著性差異(P﹤0.01)。RT-PCR：在 I型膠原的檢測中,第 3代細胞的條帶亮度與第1、2代相比,明顯較強,而第 4代細胞的亮度和陽性對照幾乎一樣；在Ⅱ型膠原的檢測中,第4代細胞的條帶亮度較前3代明顯較暗。倒置顯微鏡下觀察軟骨細胞接種PLGA支架材料上1天后的情況,顯示出二者粘附性較好；應(yīng)用Hoechst33258 DNA定量法測定細胞在PLGA中的生長增殖情況顯示：在接種以后,細胞即顯示出較強

5、的增殖能力,并維持 1 周左右,到第 10 天時趨于穩(wěn)定,第 14 天達到最高峰,而后少許回落,但與峰值相比無顯著性差異。隨著培養(yǎng)時間的延長,單位 DNA 產(chǎn)生 GAG 的量呈增加的趨勢,尤其是前兩周其增加幅度逐漸加大,至第17天達到峰值。
　　結(jié)論：單層培養(yǎng)環(huán)境中,軟骨細胞從第3代已經(jīng)發(fā)生去分化,開始表達纖維軟骨的 I型膠原,提示第 3代及其以后的細胞不適合做為種子細胞。第2代細胞既有很強的增殖能力,又保持了軟骨細胞的特異性表