力學負荷對體外培養(yǎng)軟骨細胞及在體軟骨的影響.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：力學因素對體外培養(yǎng)兔軟骨細胞糖胺多糖合成的影響
　　 實驗一、原代和傳代兔關節(jié)軟骨細胞糖胺多糖合成的動態(tài)觀察
　　 目的：研究傳代對體外培養(yǎng)兔關節(jié)軟骨細胞糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的影響。
　　 方法：1月齡新西蘭兔5只，無菌手術切取雙膝關節(jié)軟骨，采用0.4% Pronase酶和0.025% II型膠原酶消化分離關節(jié)軟骨細胞，體外培養(yǎng)。待

2、細胞融合時，換無血清培養(yǎng)液。于換液后12、24、36、48、60h 分別抽取上清液測量GAG 濃度。傳代兩次，重復上述過程。采用重復測量資料的方差分析檢驗P0、P1、P2 代細胞上清液液GAG 濃度的差異。
　　 結果：P2 代以內(nèi)，軟骨細胞形態(tài)無明顯變化，但P2 代細胞內(nèi)空泡狀顆粒增多。傳代后，細胞融合時間縮短，但是上清液GAG 濃度隨傳代逐漸下降（P<0.001）,且P0、P1、P2 代之間兩兩比較差異有顯著性（P<0.00

3、1）。換液60h后，P1 代軟骨細胞GAG 濃度較P0 代下降24%，P2 代較P0 代下降74%。換液后時間越長，上清液GAG 濃度越大（P<0.001）。換液后時間與傳代之間存在交互效應，時間越長，傳代細胞與原代細胞上清液GAG 濃度相差越大（P<0.001）。
　　 結論：在體外單層培養(yǎng)條件下，原代軟骨細胞GAG 合成能力最強，傳代后很快大幅下降。細胞融合后連續(xù)檢測上清液GAG 濃度是研究軟骨細胞分化的有效方法。
　

4、　 實驗二、高密度細胞培養(yǎng)對兔關節(jié)軟骨細胞糖胺多糖合成的作用
　　 目的：觀察不同接種密度下，軟骨細胞合成糖胺多糖的能力。
　　 材料與方法：1月齡新西蘭兔5只。采用0.4% Pronase酶和0.025% II型膠原酶消化分離雙膝關節(jié)關節(jié)軟骨細胞，來源于同一只兔的軟骨細胞分為兩部分，一部分以2×104/cm2 接種，傳代時仍以相同密度接種。另一部分在細胞貼壁后,人工降低細胞密度至2×103/cm2 培養(yǎng)。倒置顯微鏡下

5、觀察細胞形態(tài)和增殖情況。原代和傳1 代細胞于細胞融合后換液。換液后12，24，36，48，60h 以改良Alcian blue 染色沉淀法測定糖胺多糖質量濃度。
　　 結果：原代高密度培養(yǎng)組關節(jié)軟骨細胞為多邊形,輪廓清晰，三四天即可見集落形成，集落周邊細胞較中心瘦長，為長多邊形，傳1 代細胞形態(tài)無明顯變化。低密度培養(yǎng)細胞早期散在分布，7d 左右形成集落，細胞形態(tài)與高密度培養(yǎng)無明顯差異。原代低密度培養(yǎng)軟骨細胞長到融合所需時間較原代

6、高密度培養(yǎng)細胞所需時間長。原代低密度培養(yǎng)組上清液中糖胺多糖質量濃度顯著低于原代及傳1 代高密度培養(yǎng)組軟骨細胞（P<0.001，P<0.05），且時間越長，質量濃度相差越大。
　　 結論：與低密度培養(yǎng)相比，平面高密度培養(yǎng)可提高軟骨細胞合成糖胺多糖的能力，明顯減緩軟骨細胞的失分化速度，提示高密度培養(yǎng)更有利于軟骨細胞維持表型，是軟骨平面培養(yǎng)的較好方式。
　　 實驗三、不同強度循環(huán)拉伸對原代培養(yǎng)兔軟骨細胞糖胺多糖合成的影響

7、>　　 目的：研究不同強度的循環(huán)動態(tài)拉伸（Cyclic tenisle strain，CTS）對原代培養(yǎng)的兔關節(jié)軟骨細胞糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的影響。
　　 方法：1月齡新西蘭兔6只，無菌手術切取雙膝關節(jié)軟骨，采用0.4% Pronase酶和0.025% II型膠原酶消化分離關節(jié)軟骨細胞，來源于同一只兔的軟骨細胞分為3 部分，分別接種3 塊BioFlex 培養(yǎng)板，通過Flexercell 4

8、000系統(tǒng)分別給予正弦波形、0.3Hz、6h/d,強度分別為0%、5%、15%的CTS 刺激。于加載后24、36、48、60h 觀察細胞形態(tài)，并分別抽取上清測量GAG 濃度。采用重復測量資料的方差分析比較不同強度CTS 刺激組上清液GAG 濃度的差異。
　　 結果：細胞力學加載后可見周邊部軟骨細胞由多角形變?yōu)榧忓N形，沿培養(yǎng)皿半徑垂直方向排列。隨拉伸強度的增加，上清GAG 濃度依次上升（P<0.001）,且經(jīng)兩兩比較有顯著性差異（

9、P<0.05）。隨時間增加，上清GAG 濃度逐漸增加（P<0.001）。時間與加載條件之間存在交互效應，時間越長，加載組與對照組上清GAG 濃度相差越大（P<0.001）
　　 結論：CTS可促進單層貼壁關節(jié)軟骨細胞合成GAG，作用效果隨拉伸強度增大而增加。
　　 第二部分：大鼠膝關節(jié)負重與非負重區(qū)軟骨組織學對比分析
　　 目的：觀察大鼠膝關節(jié)軟骨負重區(qū)與非負重區(qū)組織形態(tài)、基質蛋白多糖成分和II型膠原分布差異。<

10、br>　　 方法：Wistar 大鼠5只，切取雙膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，沿矢狀面整體切片，HE 染色，PH 值1.0和2.5 阿爾新藍染色，番紅O 染色，阿爾新藍-番紅O 復染觀察軟骨形態(tài)結構和基質蛋白多糖成分，免疫組化檢測II型膠原分布并測量軟骨厚度。分別觀察負重區(qū)與非負重區(qū)軟骨形態(tài)和基質染色差異，并利用圖像分析系統(tǒng)，對基質成分染色深淺進行光密度定量，t檢驗統(tǒng)計分析。
　　 結果：負重區(qū)與非負重區(qū)軟骨厚度、細胞分布、形態(tài)結

11、構均有較大差異。負重區(qū)軟骨較非負重區(qū)明顯增厚（P<0.05），軟骨各層結構特征較非負重區(qū)更加明顯。非鈣化層負重區(qū)較非負重區(qū)阿爾新藍淺染，而番紅O 深染，經(jīng)圖像灰度分析差異均有顯著性（P<0.05），鈣化層在上述二區(qū)染色無明顯差異（P>0.05）。復合染色負重區(qū)藍染區(qū)域明顯少于非負重區(qū)（P<0.01）。負重區(qū)非負重區(qū)軟骨非鈣化層PH2.5 阿爾新藍染色明顯較PH 1.0 阿爾新藍染色加深。免疫組化未發(fā)現(xiàn)負重區(qū)與非負重區(qū)II型膠原分布存在差

12、異（P<0.05）。
　　 結論：脛骨和股骨髁負重區(qū)較非負重區(qū)厚度增加，軟骨各層結構特征更加明顯。非負重區(qū)與負重區(qū)比較，軟骨透明質酸含量明顯增加，硫酸軟骨素和硫酸角質素含量明顯減少，而II型膠原含量無差異。說明不同的受力環(huán)境造成軟骨基質成分差異。同時提示臨床用來修復負重區(qū)軟骨缺損的非負重區(qū)軟骨缺乏適應負重區(qū)力學環(huán)境的組織結構。
　　 第三部分：運動對在體軟骨的影響
　　 實驗一、大鼠跑步裝置的設計與應用
　

13、　 目的：研制一種誘導大鼠進行定量勻速跑步運動的實驗裝置。
　　 方法：以外購跑步機提供勻速運動平面，支架將自制罩盒架于跑步機上限制大鼠跑步范圍。罩盒前部暗室誘導大鼠進入，中部強光刺激大鼠進入前部暗室，尾部與電擊器連接的電極對大鼠進行電刺激驅趕。
　　 結論：此設計充分利用大鼠趨暗本能和學習能力，減少了電擊刺激的影響，并且具有成本低，易于操控的特點是研究跑步運動對大鼠運動系統(tǒng)影響的有力工具。
　　 實驗二、長距

14、離平板跑步運動對大鼠膝關節(jié)蛋白多糖分布的影響
　　 目的：觀察長距離平板跑步運動對大鼠關節(jié)軟骨蛋白多糖分布的影響。
　　 方法：Wistar大鼠10只，隨機分為對照組和跑步組。對照組籠養(yǎng)，跑步組每天以20m/min速度，連續(xù)跑步1000m。連續(xù)訓練45天后，處死大鼠，切取雙膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，沿矢狀面整體切片，HE染色，番紅O染色。觀察脛骨內(nèi)側平臺負重區(qū)軟骨形態(tài)結構和基質染色差異，利用圖像分析系統(tǒng)，測量軟骨厚度，并

15、對軟骨各層染色深淺進行光密度定量。
　　 結論：連續(xù)長距離平板運動后，軟骨表面完整，但是軟骨厚度下降，蛋白多糖含量下降。提示連續(xù)長距離平板運動對軟骨有一定的損傷作用。
　　 實驗三、長距離上坡跑步運動對大鼠膝關節(jié)軟骨的損傷作用研究
　　 目的：觀察長距離上坡跑步運動對大鼠關節(jié)軟損傷作用。
　　 方法：成年雄性Wistar大鼠10只，隨機分為對照組和跑步運動組，每組5只,對照組籠養(yǎng)，跑步運動組每天以20m/

16、min速度，連續(xù)水平跑步1000m，連續(xù)訓練15d后，改為20°
　　 上坡跑，速度距離同前，上坡訓練30d后，處死大鼠，切取雙膝關節(jié)，固定，脫鈣，包埋，沿矢狀面整體切片，HE染色，番紅O染色觀察軟骨形態(tài)結構和基質染色差異，采用OARSI評分對脛骨平臺和股骨髁軟骨損傷進行評價。
　　 結論：連續(xù)長距離上坡運動，可造成軟骨應力負荷增加，導致軟骨發(fā)生明顯損傷。
　　 第四部分：膝骨關節(jié)炎放射學骨贅表現(xiàn)與內(nèi)翻角相關性分

17、析
　　 目的：探討膝骨關節(jié)炎患者放射檢查骨贅表現(xiàn)與膝關節(jié)內(nèi)翻角的關系。
　　 方法：利用自制Ｘ光測量板對膝骨關節(jié)炎患者13例，共18 膝，行DR 照相，測量膝關節(jié)內(nèi)翻角。利用Photoshop軟件通過數(shù)碼影像測量骨贅長度。骨贅長度與脛骨平臺寬度的比值，稱為突起指數(shù)，用以排除個體大小差異和投照放大等因素對骨贅長度測量的影響。應用SPSS軟件通過Pearson 相關檢驗探索膝關節(jié)骨贅大小和外翻角之間的關系。