力學(xué)負(fù)荷對(duì)體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞及在體軟骨的影響.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：力學(xué)因素對(duì)體外培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞糖胺多糖合成的影響
　　 實(shí)驗(yàn)一、原代和傳代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞糖胺多糖合成的動(dòng)態(tài)觀察
　　 目的：研究傳代對(duì)體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的影響。
　　 方法：1月齡新西蘭兔5只，無(wú)菌手術(shù)切取雙膝關(guān)節(jié)軟骨，采用0.4% Pronase酶和0.025% II型膠原酶消化分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，體外培養(yǎng)。待

2、細(xì)胞融合時(shí)，換無(wú)血清培養(yǎng)液。于換液后12、24、36、48、60h 分別抽取上清液測(cè)量GAG 濃度。傳代兩次，重復(fù)上述過(guò)程。采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析檢驗(yàn)P0、P1、P2 代細(xì)胞上清液液GAG 濃度的差異。
　　 結(jié)果：P2 代以內(nèi)，軟骨細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，但P2 代細(xì)胞內(nèi)空泡狀顆粒增多。傳代后，細(xì)胞融合時(shí)間縮短，但是上清液GAG 濃度隨傳代逐漸下降（P<0.001）,且P0、P1、P2 代之間兩兩比較差異有顯著性（P<0.00

3、1）。換液60h后，P1 代軟骨細(xì)胞GAG 濃度較P0 代下降24%，P2 代較P0 代下降74%。換液后時(shí)間越長(zhǎng)，上清液GAG 濃度越大（P<0.001）。換液后時(shí)間與傳代之間存在交互效應(yīng)，時(shí)間越長(zhǎng)，傳代細(xì)胞與原代細(xì)胞上清液GAG 濃度相差越大（P<0.001）。
　　 結(jié)論：在體外單層培養(yǎng)條件下，原代軟骨細(xì)胞GAG 合成能力最強(qiáng)，傳代后很快大幅下降。細(xì)胞融合后連續(xù)檢測(cè)上清液GAG 濃度是研究軟骨細(xì)胞分化的有效方法。
　

4、　 實(shí)驗(yàn)二、高密度細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞糖胺多糖合成的作用
　　 目的：觀察不同接種密度下，軟骨細(xì)胞合成糖胺多糖的能力。
　　 材料與方法：1月齡新西蘭兔5只。采用0.4% Pronase酶和0.025% II型膠原酶消化分離雙膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，來(lái)源于同一只兔的軟骨細(xì)胞分為兩部分，一部分以2×104/cm2 接種，傳代時(shí)仍以相同密度接種。另一部分在細(xì)胞貼壁后,人工降低細(xì)胞密度至2×103/cm2 培養(yǎng)。倒置顯微鏡下

5、觀察細(xì)胞形態(tài)和增殖情況。原代和傳1 代細(xì)胞于細(xì)胞融合后換液。換液后12，24，36，48，60h 以改良Alcian blue 染色沉淀法測(cè)定糖胺多糖質(zhì)量濃度。
　　 結(jié)果：原代高密度培養(yǎng)組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為多邊形,輪廓清晰，三四天即可見集落形成，集落周邊細(xì)胞較中心瘦長(zhǎng)，為長(zhǎng)多邊形，傳1 代細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。低密度培養(yǎng)細(xì)胞早期散在分布，7d 左右形成集落，細(xì)胞形態(tài)與高密度培養(yǎng)無(wú)明顯差異。原代低密度培養(yǎng)軟骨細(xì)胞長(zhǎng)到融合所需時(shí)間較原代

6、高密度培養(yǎng)細(xì)胞所需時(shí)間長(zhǎng)。原代低密度培養(yǎng)組上清液中糖胺多糖質(zhì)量濃度顯著低于原代及傳1 代高密度培養(yǎng)組軟骨細(xì)胞（P<0.001，P<0.05），且時(shí)間越長(zhǎng)，質(zhì)量濃度相差越大。
　　 結(jié)論：與低密度培養(yǎng)相比，平面高密度培養(yǎng)可提高軟骨細(xì)胞合成糖胺多糖的能力，明顯減緩軟骨細(xì)胞的失分化速度，提示高密度培養(yǎng)更有利于軟骨細(xì)胞維持表型，是軟骨平面培養(yǎng)的較好方式。
　　 實(shí)驗(yàn)三、不同強(qiáng)度循環(huán)拉伸對(duì)原代培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞糖胺多糖合成的影響

7、>　　 目的：研究不同強(qiáng)度的循環(huán)動(dòng)態(tài)拉伸（Cyclic tenisle strain，CTS）對(duì)原代培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAG）合成的影響。
　　 方法：1月齡新西蘭兔6只，無(wú)菌手術(shù)切取雙膝關(guān)節(jié)軟骨，采用0.4% Pronase酶和0.025% II型膠原酶消化分離關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，來(lái)源于同一只兔的軟骨細(xì)胞分為3 部分，分別接種3 塊BioFlex 培養(yǎng)板，通過(guò)Flexercell 4

8、000系統(tǒng)分別給予正弦波形、0.3Hz、6h/d,強(qiáng)度分別為0%、5%、15%的CTS 刺激。于加載后24、36、48、60h 觀察細(xì)胞形態(tài)，并分別抽取上清測(cè)量GAG 濃度。采用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析比較不同強(qiáng)度CTS 刺激組上清液GAG 濃度的差異。
　　 結(jié)果：細(xì)胞力學(xué)加載后可見周邊部軟骨細(xì)胞由多角形變?yōu)榧忓N形，沿培養(yǎng)皿半徑垂直方向排列。隨拉伸強(qiáng)度的增加，上清GAG 濃度依次上升（P<0.001）,且經(jīng)兩兩比較有顯著性差異（

9、P<0.05）。隨時(shí)間增加，上清GAG 濃度逐漸增加（P<0.001）。時(shí)間與加載條件之間存在交互效應(yīng)，時(shí)間越長(zhǎng)，加載組與對(duì)照組上清GAG 濃度相差越大（P<0.001）
　　 結(jié)論：CTS可促進(jìn)單層貼壁關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞合成GAG，作用效果隨拉伸強(qiáng)度增大而增加。
　　 第二部分：大鼠膝關(guān)節(jié)負(fù)重與非負(fù)重區(qū)軟骨組織學(xué)對(duì)比分析
　　 目的：觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨負(fù)重區(qū)與非負(fù)重區(qū)組織形態(tài)、基質(zhì)蛋白多糖成分和II型膠原分布差異。<

10、br>　　 方法：Wistar 大鼠5只，切取雙膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，沿矢狀面整體切片，HE 染色，PH 值1.0和2.5 阿爾新藍(lán)染色，番紅O 染色，阿爾新藍(lán)-番紅O 復(fù)染觀察軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)和基質(zhì)蛋白多糖成分，免疫組化檢測(cè)II型膠原分布并測(cè)量軟骨厚度。分別觀察負(fù)重區(qū)與非負(fù)重區(qū)軟骨形態(tài)和基質(zhì)染色差異，并利用圖像分析系統(tǒng)，對(duì)基質(zhì)成分染色深淺進(jìn)行光密度定量，t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：負(fù)重區(qū)與非負(fù)重區(qū)軟骨厚度、細(xì)胞分布、形態(tài)結(jié)

11、構(gòu)均有較大差異。負(fù)重區(qū)軟骨較非負(fù)重區(qū)明顯增厚（P<0.05），軟骨各層結(jié)構(gòu)特征較非負(fù)重區(qū)更加明顯。非鈣化層負(fù)重區(qū)較非負(fù)重區(qū)阿爾新藍(lán)淺染，而番紅O 深染，經(jīng)圖像灰度分析差異均有顯著性（P<0.05），鈣化層在上述二區(qū)染色無(wú)明顯差異（P>0.05）。復(fù)合染色負(fù)重區(qū)藍(lán)染區(qū)域明顯少于非負(fù)重區(qū)（P<0.01）。負(fù)重區(qū)非負(fù)重區(qū)軟骨非鈣化層PH2.5 阿爾新藍(lán)染色明顯較PH 1.0 阿爾新藍(lán)染色加深。免疫組化未發(fā)現(xiàn)負(fù)重區(qū)與非負(fù)重區(qū)II型膠原分布存在差

12、異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：脛骨和股骨髁負(fù)重區(qū)較非負(fù)重區(qū)厚度增加，軟骨各層結(jié)構(gòu)特征更加明顯。非負(fù)重區(qū)與負(fù)重區(qū)比較，軟骨透明質(zhì)酸含量明顯增加，硫酸軟骨素和硫酸角質(zhì)素含量明顯減少，而II型膠原含量無(wú)差異。說(shuō)明不同的受力環(huán)境造成軟骨基質(zhì)成分差異。同時(shí)提示臨床用來(lái)修復(fù)負(fù)重區(qū)軟骨缺損的非負(fù)重區(qū)軟骨缺乏適應(yīng)負(fù)重區(qū)力學(xué)環(huán)境的組織結(jié)構(gòu)。
　　 第三部分：運(yùn)動(dòng)對(duì)在體軟骨的影響
　　 實(shí)驗(yàn)一、大鼠跑步裝置的設(shè)計(jì)與應(yīng)用
　

13、　 目的：研制一種誘導(dǎo)大鼠進(jìn)行定量勻速跑步運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)裝置。
　　 方法：以外購(gòu)跑步機(jī)提供勻速運(yùn)動(dòng)平面，支架將自制罩盒架于跑步機(jī)上限制大鼠跑步范圍。罩盒前部暗室誘導(dǎo)大鼠進(jìn)入，中部強(qiáng)光刺激大鼠進(jìn)入前部暗室，尾部與電擊器連接的電極對(duì)大鼠進(jìn)行電刺激驅(qū)趕。
　　 結(jié)論：此設(shè)計(jì)充分利用大鼠趨暗本能和學(xué)習(xí)能力，減少了電擊刺激的影響，并且具有成本低，易于操控的特點(diǎn)是研究跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)影響的有力工具。
　　 實(shí)驗(yàn)二、長(zhǎng)距

14、離平板跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)蛋白多糖分布的影響
　　 目的：觀察長(zhǎng)距離平板跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨蛋白多糖分布的影響。
　　 方法：Wistar大鼠10只，隨機(jī)分為對(duì)照組和跑步組。對(duì)照組籠養(yǎng)，跑步組每天以20m/min速度，連續(xù)跑步1000m。連續(xù)訓(xùn)練45天后，處死大鼠，切取雙膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，沿矢狀面整體切片，HE染色，番紅O染色。觀察脛骨內(nèi)側(cè)平臺(tái)負(fù)重區(qū)軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)和基質(zhì)染色差異，利用圖像分析系統(tǒng)，測(cè)量軟骨厚度，并

15、對(duì)軟骨各層染色深淺進(jìn)行光密度定量。
　　 結(jié)論：連續(xù)長(zhǎng)距離平板運(yùn)動(dòng)后，軟骨表面完整，但是軟骨厚度下降，蛋白多糖含量下降。提示連續(xù)長(zhǎng)距離平板運(yùn)動(dòng)對(duì)軟骨有一定的損傷作用。
　　 實(shí)驗(yàn)三、長(zhǎng)距離上坡跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的損傷作用研究
　　 目的：觀察長(zhǎng)距離上坡跑步運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟損傷作用。
　　 方法：成年雄性Wistar大鼠10只，隨機(jī)分為對(duì)照組和跑步運(yùn)動(dòng)組，每組5只,對(duì)照組籠養(yǎng)，跑步運(yùn)動(dòng)組每天以20m/

16、min速度，連續(xù)水平跑步1000m，連續(xù)訓(xùn)練15d后，改為20°
　　 上坡跑，速度距離同前，上坡訓(xùn)練30d后，處死大鼠，切取雙膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，沿矢狀面整體切片，HE染色，番紅O染色觀察軟骨形態(tài)結(jié)構(gòu)和基質(zhì)染色差異，采用OARSI評(píng)分對(duì)脛骨平臺(tái)和股骨髁軟骨損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 結(jié)論：連續(xù)長(zhǎng)距離上坡運(yùn)動(dòng)，可造成軟骨應(yīng)力負(fù)荷增加，導(dǎo)致軟骨發(fā)生明顯損傷。
　　 第四部分：膝骨關(guān)節(jié)炎放射學(xué)骨贅表現(xiàn)與內(nèi)翻角相關(guān)性分

17、析
　　 目的：探討膝骨關(guān)節(jié)炎患者放射檢查骨贅表現(xiàn)與膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻角的關(guān)系。
　　 方法：利用自制Ｘ光測(cè)量板對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎患者13例，共18 膝，行DR 照相，測(cè)量膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻角。利用Photoshop軟件通過(guò)數(shù)碼影像測(cè)量骨贅長(zhǎng)度。骨贅長(zhǎng)度與脛骨平臺(tái)寬度的比值，稱為突起指數(shù)，用以排除個(gè)體大小差異和投照放大等因素對(duì)骨贅長(zhǎng)度測(cè)量的影響。應(yīng)用SPSS軟件通過(guò)Pearson 相關(guān)檢驗(yàn)探索膝關(guān)節(jié)骨贅大小和外翻角之間的關(guān)系。