模擬日光照射后皮膚屏障損傷與真菌感染的相關性研究.pdf

1、真菌感染疾病是皮膚科臨床中最常見的疾病之一，占皮膚科總門診量的50％左右。近年來隨著抗生素和免疫抑制劑的廣泛應用、腫瘤、艾滋病、器官移植的增加以及環(huán)境的惡化，真菌感染的發(fā)病率逐年增高，其中環(huán)境因素已成為多種疾病發(fā)生和加重的重要因素。由于臭氧層的破壞，地球表面紫外線輻射量增加，使得紫外線的危害更加嚴重。紫外線對各種疾病如細菌、病毒感染及腫瘤等疾病的影響已有大量研究報道，但紫外線對真菌感染的影響仍未明確。
　　 環(huán)境中紫外線包括UV

2、A(320～400nm)、UVB(280～320nm)、UVC(＜280nm)。目前，關于紫外線的研究大多集中于UVA和UVB，關于UVC的研究報道甚少。UVA和UVB對皮膚影響包括引起紅斑、色素沉著、物理結(jié)構損害及免疫損傷等，但兩者引起皮膚光損傷的臨床表現(xiàn)及機制可能存在差異，至今仍無詳盡文獻報道。
　　 真菌是真核生物，從傳統(tǒng)形態(tài)學上可分為酵母相和菌絲相。目前已發(fā)現(xiàn)致病真菌約400多種。多數(shù)真菌在環(huán)境中普遍存在，并可熟練感知周

3、圍環(huán)境變化，產(chǎn)生適應性反應從而促進其在惡劣多變的環(huán)境中生存。這一特性促使它們可與植物、動物或人等宿主發(fā)生相互作用，形成共棲狀態(tài)、潛伏感染或致病狀態(tài)。
　　 真菌感染的發(fā)生除了真菌自身毒力因素的作用外，宿主防御系統(tǒng)也對其有重要影響，并決定著真菌感染的轉(zhuǎn)歸和預后。作為機體的首道防御屏障，皮膚的屏障功能有廣義與狹義之分。廣義的皮膚屏障不僅包括皮膚的物理屏障作用，還包括皮膚的免疫屏障、色素屏障、神經(jīng)屏障等;狹義皮膚屏障指皮膚的完整性結(jié)構

4、，尤其是角質(zhì)層與其間脂質(zhì)構成的“磚墻結(jié)構”。皮膚屏障的結(jié)構基礎主要是角質(zhì)層、脂質(zhì)和多種天然保濕因子。此外，表皮各種蛋白質(zhì)、無機鹽等也是其重要組成部分。表皮脂質(zhì)包括神經(jīng)酰胺、(.)豐富的磷脂、游離膽固醇及不飽和脂肪酸等，這些脂質(zhì)在基底細胞向角質(zhì)層分化過程中含量逐漸增高，到達角質(zhì)層時從細胞間隙排出，形成防止水分丟失的屏障。天然保濕因子是由表皮中間絲相關蛋白分解而成，對保持皮膚水合作用有重要意義，常見的天然保濕因子包括某些氨基酸、吡咯烷酮羧酸

5、、尿刊酸、尿素等多種低分子物質(zhì)。免疫屏障包括以T細胞、朗格漢斯細胞、吞噬細胞、肥大細胞、中性粒細胞等為主的細胞水平免疫，同時還包括以各種細胞因子、腫瘤壞死因子、尿刊酸、抗微生物肽等為主的分子水平免疫。
　　 迄今為止，已有相關文獻報道紫外線對皮膚屏障的影響，及紫外線照射對皮膚發(fā)生細菌、病毒感染及腫瘤等的影響，但對真菌感染影響的研究較少;并且多數(shù)實驗研究UVA、UVB的單獨作用及其機制。但環(huán)境中紫外線是UVA與UVB以一定比例聯(lián)合

6、照射，從而影響皮膚屏障功能。因此，本研究利用SUV-1000日光紫外線模擬器作為光源，經(jīng)預實驗后選擇適合的動物作為實驗對象，選取親動物性致病真菌中最常見的須癬毛癬菌為實驗菌株，構建不同劑量紫外線照射后皮膚日曬傷模型，并檢測皮膚屏障改變從而研究模擬日光導致皮膚屏障損傷的機制。同時構建紫外線照射后須癬毛癬菌感染模型，進一步研究紫外線照射后皮膚屏障損傷與真菌感染的相關性和相關機制，以期為創(chuàng)傷性真菌感染的防治研究提供基礎。
　　 第一章

7、，實驗動物最小紅斑量(minimalerythemadoseMED)的測定
　　 1.目的:
　　 分別檢測豚鼠、C57BL/6、ICR小鼠的最小紅斑量，并確定何種為本實驗最適實驗動物。
　　 2.方法:
　　 利用SUV-1000日光模擬器作為光源，MED測定器被分為劑量依次遞減的8個照射孔，每次照射前利用UVA、UVB輻照計測出光源輸出功率。豚鼠10只，每只照射1組（即8個）光斑劑量;C57BL/6、

8、ICR小鼠分別30只，分別每3只為1組，每只依次照射2個光斑，即1組6個光斑劑量。將實驗動物備皮，照射時固定于模擬日光照射儀光源下，使皮膚緊貼照射孔，同時遮蔽眼睛使其免于模擬日光照射。豚鼠8孔照射劑量范圍UVA約為160～2500mJ/cm2，UVB約為15～200mJ/cm2，由小到大以約1.414倍遞增;C57BL/6、ICR小鼠6個光斑照射范圍UVA約為100～1800mJ/cm2，UVB約為10～160mJ/cm2，由小到大以約

9、1.414倍遞增。照射后觀察48小時內(nèi)各組小鼠皮膚紅斑反應情況，以照射后24小時各組出現(xiàn)可見紅斑的最小照射劑量為各組最小紅斑量，三種實驗動物最小紅斑量分別求均值，記為三種鼠的最小紅斑量。
　　 3.結(jié)果:
　　 模擬日光照射后計算三種鼠的最小紅斑量，C57BL/6小鼠UVA498mJ/cm2，UVB42mJ/cm2，總劑量540mJ/cm2;ICR小鼠UVA644.9mJ/cm2，UVB55.4mJ/cm2,總劑量700

10、.3mJ/cm2;豚鼠UVA1430mJ/cm2，UVB122mJ/cm2，總劑量1552mJ/cm2。綜合考慮模擬日光照射操作方式、實驗動物備皮處理的影響及后期真菌感染實驗操作等因素，選取豚鼠為本實驗的最適實驗動物。
　　 第二章，模擬日光照射后豚鼠皮膚屏障損傷及其與真菌感染相關性分析
　　 1.目的:
　　 構建模擬日光照射導致皮膚光損傷動物模型及光損傷后須癬毛癬菌感染動物模型，研究模擬日光照射與皮膚屏障損傷

11、及其與須癬毛癬菌感染的關系。
　　 2.方法:
　　 (1)模擬日光照射及照射后真菌感染
　　 利用SUV-1000日光紫外線模擬器照射豚鼠背部皮膚，測出其MED后。將70只實驗豚鼠分為5組，第1、2、3、4組分別以0MED、0.5MED、1MED、4MED連續(xù)3天照射其背部備皮后皮膚，每次照射前重新備皮。連續(xù)3天照射完成后次日，每組隨機抽取6只檢測其皮膚屏障改變。完畢后將預先制備的須癬毛癬菌懸液均勻涂抹于每組剩

12、余豚鼠照射部位皮膚。第5組為空白對照組，脫毛后不進行照射，背部涂抹生理鹽水以做對照。自然晾干后放置于籠中單獨飼養(yǎng)，自接種之日起觀察豚鼠背部皮膚臨床表現(xiàn)的變化，為期28天，出現(xiàn)紅斑、脫屑、結(jié)痂、糜爛各計為1分，同時出現(xiàn)多種臨床表現(xiàn)時分數(shù)累加。
　　 (2)照射后皮膚屏障檢測
　　 各組分別照射完畢后次日，每組分別隨機抽取6只，10％烏拉坦麻醉后于照射部位用皮膚鉆孔器取全層皮膚，10％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行HE染色及

13、CD4+、CD8+T細胞抗體染色。同時取豚鼠背部皮膚引流淋巴結(jié)，即腹股溝淋巴結(jié)，10％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片后行HE染色及CD4、CD8抗體染色。
　　 (3)真菌感染鑒定
　　 真菌感染鑒定方法采用真菌鏡檢、真菌培養(yǎng)和組織病理方法。真菌直接鏡檢和培養(yǎng)于接種后4日開始，刮取豚鼠背部皮屑及毛發(fā)，進行顯微鏡下10％氫氧化鉀常規(guī)鏡檢，并留取少量皮屑及毛發(fā)，接種于含氯霉素和放線菌酮的SDA培養(yǎng)基上，每隔4天進行一次，至感染后

14、第28天，觀察皮膚及毛發(fā)真菌感染情況。真菌培養(yǎng)后7～10天，觀察培養(yǎng)菌落形態(tài)，并利用無菌接種針挑取少許培養(yǎng)菌落進行乳酸酚棉蘭染色和PDA小培養(yǎng)，顯微鏡下鑒定。接種后第10天，每組豚鼠中隨機抽取2只處死，于感染部位取皮膚全層組織進行PAS染色，進一步鑒定感染結(jié)果。
　　 (4)統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。1、2、3、4組感染后評分數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。多組比較采用重復測量設計資

15、料的方差分析，若數(shù)據(jù)滿足球形檢驗，結(jié)果不需要校正;若不滿足球形檢驗，則采用校正的Greenhouse-Geisser法。兩兩組間比較采用LSD檢驗。各組評分-時間曲線下面積、最初感染時間和到達最高分值時間以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較，若方差齊同采用LSD檢驗，方差不齊采用Tamhane'sT2檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 3.結(jié)果:
　　 感染后大體改變:

16、第5組空白對照組未發(fā)生感染變化，第3、4于接種后3天即出現(xiàn)皮膚紅斑反應，第2組接種后第4天出現(xiàn)紅斑，第1組空白感染組接種后第5天開始出現(xiàn)皮膚紅斑反應。感染中期，同一天各組豚鼠皮損第4組臨床表現(xiàn)較1、2、3組明顯嚴重。第1、2組于感染后21出現(xiàn)個別豚鼠皮損恢復，表現(xiàn)為痂皮脫落，遺留紅斑及少量脫屑;第3、4組感染后皮損于23天始逐漸恢復。對感染過程中各組豚鼠皮損評分進行統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示:4組評分組間差異有統(tǒng)計學意義(P=0.049)。4組

17、評分組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)，第4組皮損評分與1、2組差異均有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.022、0.037），第4組與第3組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.108)，第1、2、3三組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（1、2組比較P=0.747，1、3組比較P=0.377，2、3組比較P=0.503）。4組曲線下面積組間比較無統(tǒng)計學差異(P=0.070)，最初感染時間組間比較無統(tǒng)計學差異(P=0.066)，達到最高分值的時間無統(tǒng)計

18、學差異(P=0.729)。
　　 皮膚屏障功能檢測結(jié)果表明，照射后可見不同程度物理屏障損傷，并隨照射劑量增加呈現(xiàn)加重趨勢。皮膚CD4+、CD8+T細胞免疫組化染色，第1組未照射組背部皮膚和淋巴結(jié)中均可見CD4表達和CD8少量表達。第2、3、4組皮膚和淋巴結(jié)中CD4表達強度均較第1組下降，CD8表達強度有增加的趨勢。
　　 真菌檢查結(jié)果顯示第1、2、3、4組豚鼠真菌全部為陽性，第5組空白對照組未見真菌感染。第1～4組豚鼠于

19、接種須癬毛癬菌后第4天刮取背部皮屑，直接鏡檢結(jié)果全部陽性，培養(yǎng)結(jié)果通過觀察菌落形態(tài)、乳酸酚棉蘭染色及小培養(yǎng)鑒定全部為須癬毛癬菌。第1～4組豚鼠皮膚組織切片PAS染色鏡下可見角質(zhì)層、毛根及毛干內(nèi)大量孢子及少量菌絲分布，染成深紅色，第5組未見菌絲及孢子。
　　 結(jié)論:
　　 1.豚鼠、C57BL/6、ICR小鼠三種動物最小紅斑量實驗結(jié)果表明，豚鼠更適合模擬日光照射后真菌感染實驗。其優(yōu)點在于:背部面積較大，可8孔光斑同時照射在

20、一只豚鼠上，減少最小紅斑量誤差;采用硫化鋇脫毛，對皮膚的損傷較小;性情溫和，模擬日光照射時便于操作;其背部皮膚更易接種真菌，并且便于觀察感染后臨床表現(xiàn)。
　　 2.以大于或等于最小紅斑量的模擬日光照射后，豚鼠皮膚可發(fā)生日曬紅斑反應，小于最小紅斑劑量照射不出現(xiàn)紅斑反應;模擬日光照射后皮膚屏障發(fā)生明顯損傷，并且在一定照射范圍內(nèi)隨劑量增加皮膚損傷呈加重趨勢;模擬日光照射劑量對真菌感染的發(fā)生率無影響，實驗結(jié)果顯示照射組和非照射組豚鼠感染