模擬強(qiáng)日光照射對兔眼視網(wǎng)膜損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、光是視覺系統(tǒng)進(jìn)化和發(fā)育的動(dòng)力，視網(wǎng)膜是感受外界光線形成視覺的重要組織結(jié)構(gòu)，外界光線只有到達(dá)功能正常的視網(wǎng)膜才能形成視覺圖像。但是，當(dāng)光線的光強(qiáng)度、光照時(shí)間等超過了視網(wǎng)膜的承受力，將會(huì)造成視網(wǎng)膜的光損傷。視網(wǎng)膜是視覺器官中重要組織結(jié)構(gòu)，彳艮容易受到光的損傷。由于眼的屈光介質(zhì)有很強(qiáng)的聚焦作用，可將入射光束會(huì)聚成很小的光斑，從而使視網(wǎng)膜單位面積上接受的光能比入射到角膜的光強(qiáng)約105倍。早在17世紀(jì)瑞士醫(yī)生Bonetus就描述了日光引起的視力損

2、害。1966年Noell等報(bào)道，一定量的光，即使低于熱損傷的閾值，也可引起受試小鼠的視網(wǎng)膜損傷。烈日下太陽光照度可高達(dá)1300001ux以上，尤其是在高山、沙漠、海島及艦船甲板等環(huán)境中會(huì)增強(qiáng)光的輻射作用，強(qiáng)光下無特殊防護(hù)很容易發(fā)生視網(wǎng)膜光損傷。以往實(shí)驗(yàn)通常采用日光燈、手術(shù)顯微鏡等較低照度的可見光，較長時(shí)間照射造成光損傷。本實(shí)驗(yàn)采用光譜最接近太陽光的氙燈作為致傷光源，300001ux模擬晴天少云時(shí)的太陽光，濾光片濾掉紅外光線，不會(huì)引起明顯

3、的溫度升高，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的熱損傷，實(shí)驗(yàn)條件接近太陽光對視網(wǎng)膜的損傷。以往對視網(wǎng)膜光損傷病理學(xué)改變的研究多集中在損傷后的早期，本實(shí)驗(yàn)對光損傷后視網(wǎng)膜的病理學(xué)改變進(jìn)行了較長時(shí)間的動(dòng)態(tài)觀察。 目的： 本課題從組織形態(tài)等方面研究視網(wǎng)膜光損傷后感光細(xì)胞的改變特征及其發(fā)生機(jī)制。通過300001ux光照射兔眼，采用光鏡、透射電鏡與末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(in situterminaldeoxynucleotib

4、yl transferase mediateddUTP-digoxigenin(biotin) nick end-labeling，TUNEL)技術(shù)對光損傷后視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的病理學(xué)改變進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，探討強(qiáng)日光照射對視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)的影響及光損傷的致傷機(jī)理。 方法： 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取月齡相當(dāng)、健康成年新西蘭白兔25只，雌雄不限，體重2～2.5kg。隨機(jī)將動(dòng)物分為3組。正常對照組5只兔，15min光照組5只兔和30m

5、in光照組15只兔(分別在光照后2d、7d和14d各取5只兔進(jìn)行觀察)。動(dòng)物室內(nèi)相對濕度40％～60％，室內(nèi)溫度21～24℃。所有實(shí)驗(yàn)用家兔均在自然明及暗各12 h的自然循環(huán)光環(huán)境下適應(yīng)7d，強(qiáng)光照前暗適應(yīng)24 h。 二、光損傷模型的建立 將實(shí)驗(yàn)兔雙眼分別用復(fù)方托品酰胺散大瞳孔至8mm，將光照組兔固定(只有頭部外露)，放置開瞼器使兔眼暴露在氙燈光照下，濾光片濾掉紅外光線，光源照度為300001ux。根據(jù)分組照射時(shí)間分別控

6、制在15min和30min，暗適應(yīng)30min后送回動(dòng)物室正常條件下飼養(yǎng)，15min光照組在光照后2d取材進(jìn)行觀察，30min光照組在光照后2d、7d和14d不同時(shí)間分別取材進(jìn)行觀察。正常飼養(yǎng)組散瞳后不予光照，飼養(yǎng)2d后取材觀察。 三、光學(xué)顯微鏡觀察 全麻下摘取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼球，去除眼前節(jié)，放入10％福爾馬林溶液中固定48小時(shí)。自視神經(jīng)根顳側(cè)1PD處作矢狀切面取材，石蠟包埋，5μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色與TUNEL標(biāo)記染色，光

7、學(xué)顯微鏡下觀察。 四、透射電鏡觀察 全麻下摘取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼球，去除眼前節(jié)，2，5％戊二醛固定2小時(shí)(4℃)；取視神經(jīng)根顳側(cè)IPD處的視網(wǎng)膜，切成1mm×0.5mm矩形組織塊；磷酸緩沖液沖洗三次；1％鋨酸固定2小時(shí)；雙蒸水沖洗三次；梯度酒精脫水；置換2次；純樹脂包埋；修塊，半薄切片，天青-美蘭染色，光鏡下定位觀察；超薄切片，醋酸雙氧鈾，枸櫞酸鉛染色；Philips EM208s電鏡觀察 五、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡檢測

8、 切片常規(guī)脫蠟水化；將一燒杯盛200ml的0.01 M、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90～95℃，迅速放入切片，加入雙蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷卻，將玻片移至PBS(20～25℃)洗3次；加20％正常牛血清室溫30 min；將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT)； PBS洗3次；3％H2O2甲醇液室溫阻斷10min；37℃溫育90min；加POD轉(zhuǎn)化劑，37℃溫育

9、30min；PBS洗5min×3次；DAB/H2O2顯色；蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。 在TUNEL標(biāo)記切片的視網(wǎng)膜后極部隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)感光細(xì)胞總數(shù)及呈陽性著色的凋亡感光細(xì)胞數(shù)，取其平均值并計(jì)算感光細(xì)胞凋亡率。 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel記錄，利用SPSS13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對兩組均數(shù)間比較行t檢驗(yàn)，以x±s表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的

10、判定標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 一、光學(xué)顯微鏡觀察 正常組視網(wǎng)膜組織未見明顯病理改變，結(jié)構(gòu)清晰完整。15min光照組2d時(shí)觀察，桿體錐體層結(jié)構(gòu)紊亂，界線不清；外顆粒層細(xì)胞核排列疏松紊亂，可見細(xì)胞間水腫：內(nèi)顆粒層細(xì)胞核排列疏松紊亂；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層偶見細(xì)胞核消失，胞漿呈空泡狀。30min光照組2d時(shí)觀察，桿體錐體層結(jié)構(gòu)明顯紊亂，界線不清，可見組織斷裂；外顆粒層細(xì)胞核排列疏松紊亂，細(xì)胞間水腫明顯增多；內(nèi)顆粒層細(xì)胞核排列疏松紊亂，細(xì)胞

11、核消失，胞漿呈空泡狀；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層多數(shù)細(xì)胞核消失，胞漿呈空泡狀。30min光照組7d時(shí)觀察，桿體錐體層可見大部分組織斷裂崩解；外顆粒層細(xì)胞核排列疏松紊亂，部分細(xì)胞核消失，胞漿呈空泡狀；內(nèi)顆粒層細(xì)胞核排列紊亂，細(xì)胞核數(shù)量明顯減少，胞漿呈空泡狀；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層絕大部分細(xì)胞核消失，胞漿呈空泡狀。30min光照組14d時(shí)觀察，桿體錐體層結(jié)構(gòu)比較整齊，斷裂崩解組織明顯修復(fù)；外顆粒層細(xì)胞核排列比較整齊，偶見細(xì)胞胞漿呈空泡狀；內(nèi)顆粒層細(xì)胞核排列比較整齊

12、；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層可見部分細(xì)胞核消失，胞漿呈空泡狀。 二、透射電鏡觀察 正常組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)基本正常。15min光照組2d時(shí)觀察，桿體錐體層外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)紊亂，板層結(jié)構(gòu)離散，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，個(gè)別嵴斷裂；外顆粒層細(xì)胞胞漿有空泡樣改變；內(nèi)顆粒層胞漿輕度腫脹；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞形態(tài)基本正常。30min光照組2d時(shí)觀察，桿體錐體層外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)紊亂，板層結(jié)構(gòu)重度離散，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，嵴斷裂；外顆粒層細(xì)胞胞漿有空泡樣改變；內(nèi)顆粒層胞漿輕度腫脹；

13、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿輕度腫脹。30min光照組7d時(shí)觀察，桿體錐體層外節(jié)膜盤組織結(jié)構(gòu)紊亂，板層結(jié)構(gòu)消失，空泡化，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，嵴斷裂；外顆粒層細(xì)胞胞質(zhì)腫脹，大量空泡樣改變，排列紊亂，部分胞膜破壞；內(nèi)顆粒層胞漿高度腫脹，呈空泡樣改變，可見部分胞膜破壞；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可見胞漿腫脹，胞膜破壞。30min光照組14d時(shí)觀察，桿體錐體層外節(jié)膜盤組織結(jié)構(gòu)較規(guī)則，板層結(jié)構(gòu)比較致密，內(nèi)節(jié)線粒體腫脹，嵴斷裂；外顆粒層細(xì)胞胞漿腫脹減輕，排列較整齊；內(nèi)顆粒層胞漿腫脹

14、減輕，排列較整齊；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞漿腫脹減輕。 三、視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡檢測 正常組視網(wǎng)膜TUNEL染色均為陰性。光照后各組外顆粒層出現(xiàn)散在分布的陽性表達(dá)細(xì)胞，表現(xiàn)為顆粒狀黃色或棕黃色著色，定位于細(xì)胞核，部分胞核邊緣著色深，中央著色淺，呈指環(huán)狀外觀。15min光照組2d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率為13.23％±0.86％，30min光照組2d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率為13.26％±1.54％，30min光照組7d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率為29.54％±1.

15、44％，30min光照組14d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率為29.21％±0.99％。15min光照組2d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率與30min光照組2d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率兩者無顯著性差異(P>0.05)；30min光照組2d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率與30min光照組7d時(shí)以及30min光照組14d時(shí)比較均具有顯著性差異(P<0.05)；30min光照組7d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率與30min光照組14d時(shí)感光細(xì)胞凋亡率兩者無顯著性差異(P>0.05)。 結(jié)論：

16、 一、本實(shí)驗(yàn)采用光譜最接近太陽光的氙燈作為致傷光源，300001ux模擬晴天少云時(shí)的太陽光，濾光片濾掉紅外光線，不會(huì)引起明顯的溫度升高，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的熱損傷，實(shí)驗(yàn)條件接近太陽光對視網(wǎng)膜的損傷，成功構(gòu)建太陽光視網(wǎng)膜損傷模型。 二、本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)300001ux模擬日光照射白兔眼15min光照組2d時(shí)就發(fā)現(xiàn)對視網(wǎng)膜造成光損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)300001ux模擬日光照射白兔眼15min，2d后可觀察到視網(wǎng)膜的光損傷病理改變。證實(shí)短時(shí)間強(qiáng)光照