左卡尼汀對(duì)高滲鹽水誘導(dǎo)的小鼠干眼模型眼表保護(hù)作用的初步研究.pdf

1、背景與目的：干眼病(dry eye disease)，又稱角結(jié)膜干燥癥(keratoconjunctivitis sicca)或者淚液功能不全綜合征(dysfunctional tear syndrome)，是指任何原因引起的淚液質(zhì)和量異常或動(dòng)力學(xué)異常導(dǎo)致的淚膜穩(wěn)定性下降，并伴有眼部不適，導(dǎo)致眼表組織病變?yōu)樘卣鞯募膊】偡Q，是最常見的眼表疾病。干眼病嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。干眼病患者的淚液滲透壓顯著升高，其滲透壓為(326±22.1)mO

2、smol/L，正常人淚液滲透壓為(302±9.7)mOsmol/L。用316 mOsmol/L作為干眼病的診斷指標(biāo)，其敏感性和特異性優(yōu)于任何其它的干眼病診斷指標(biāo)。
　　 目前干眼病的治療以人工淚液滴眼為主，通過提高淚膜穩(wěn)定性，在一定程度上能緩解干眼病患者臨床癥狀和體征，但對(duì)中、重度干眼病的治療效果不佳。自體血清作為有效的淚液替代物，無(wú)防腐劑、無(wú)抗原性，能促進(jìn)結(jié)膜、角膜上皮增殖分化而應(yīng)用于中、重度干眼病的治療，但其保存受限。因此，

3、從干眼病發(fā)病機(jī)制出發(fā)，研發(fā)一種有效治療干眼病的藥物并應(yīng)用于臨床是急待解決的問題。
　　 左卡尼汀是一種極性分子。文獻(xiàn)證實(shí)，左卡尼汀具有滲透保護(hù)的作用。哺乳動(dòng)物眼表組織中，左卡尼汀在晶狀體中濃度最高，在玻璃體中濃度最低，兔的雙眼局部應(yīng)用左卡尼汀膏劑后，角膜中左卡尼汀含量顯著增加。Pescosolido等證實(shí)人的淚液中存在左卡尼汀及其衍生物，干眼病患者淚液中左卡尼汀濃度顯著下降，作者建議使用含左卡尼汀成分的滴眼液來(lái)緩解干眼病患者眼表

4、上皮細(xì)胞的損害。研究表明，左卡尼汀對(duì)高滲(400mOsmol/L)培養(yǎng)基中的角膜上皮細(xì)胞具有滲透保護(hù)的作用。左卡尼汀作為生理性補(bǔ)充或藥物在眼科的研究中證實(shí)，1%濃度為其最佳劑量。目前，局部應(yīng)用左卡尼汀對(duì)干眼病角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞是否具有保護(hù)作用尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)在課題組前期高滲鹽水點(diǎn)眼制作小鼠干眼模型的基礎(chǔ)上，初步探討局部應(yīng)用左卡尼汀是否具有減緩小鼠干眼模型眼表?yè)p害的作用。
　　 方法：
　　 1.動(dòng)物

5、的選擇與分組6～8周齡雌性BALB/c小鼠60只，隨機(jī)數(shù)字表法分為高滲鹽水滴眼組(HO組)，高滲聯(lián)合等滲鹽水滴眼組(HO+IO組)，高滲鹽水聯(lián)合1%左卡尼汀滴眼組(HO+1%LCA組)。每組20只，雙眼取用。對(duì)HO組采用500mOsmol/L氯化鈉溶液滴眼，每天5次；對(duì)HO+IO組，先滴308mOsmol/L氯化鈉溶液，30min后，再滴500mOsmol/L氯化鈉溶液，每天各滴眼5次；對(duì)HO+1%LCA組，先滴1%左卡尼汀滴眼液，30

6、min后，再滴500mOsmol/L氯化鈉溶液，每天各滴眼5次。持續(xù)滴眼28天。
　　 2.1%左卡尼汀滴眼液的制備：左卡尼汀粉劑溶于注射用水，氯化鈉粉劑調(diào)節(jié)滲透壓至308mOsmol/L，鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.0。
　　 3.淚液分泌量的測(cè)定采用SchirmerⅠ方法測(cè)定BALB/c小鼠淚液的分泌量。在裂隙燈顯微鏡下，使用顯微鑷夾住酚紅棉線，放置于BALB/c小鼠眼睛的外眥部，60s后取出，用毫米刻度尺測(cè)量酚紅棉線濕潤(rùn)的

7、長(zhǎng)度。
　　 4.角膜熒光素染色與評(píng)分用微量加液器在BALB/c小鼠下方結(jié)膜囊內(nèi)滴入1ul5%熒光素鈉溶液，3min后，裂隙顯微鏡下用鈷藍(lán)光進(jìn)行檢查，并照相記錄。
　　 5.淚液蕨類實(shí)驗(yàn)采用自制毛細(xì)玻璃管采集BALB/c小鼠下穹隆部淚液，涂在潔凈的載玻片上，室溫干燥，在48h內(nèi)光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行蕨類結(jié)晶圖像分析，并照相記錄。
　　 6.角膜和結(jié)膜上皮的組織學(xué)觀察采用蘇木精伊紅染色在光學(xué)顯微鏡下觀察角膜上皮形態(tài)。采用

8、圖像分析軟件測(cè)量中央角膜上皮厚度。取上方穹窿部結(jié)膜，采用過碘酸-Schiff染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察上方穹窿部結(jié)膜上皮的形態(tài)。計(jì)算每個(gè)高倍視野下杯狀細(xì)胞數(shù)量。
　　 7.掃描電子顯微鏡觀察第28天在掃描電子顯微鏡下觀察角膜上皮表面的形態(tài)。
　　 8.淚液滲透壓測(cè)定首先建立BALB/c小鼠淚液滲透壓測(cè)定值轉(zhuǎn)化表。在實(shí)驗(yàn)第0、28天收集小鼠淚液，冰點(diǎn)滲透壓儀測(cè)定淚液滲透壓值，依據(jù)建立的BALB/c小鼠淚液滲透壓測(cè)定值轉(zhuǎn)化表進(jìn)

9、行淚液滲透壓的換算。
　　 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較角膜熒光素染色評(píng)分。采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析和LSD-t比較中央角膜上皮厚度、淚液的分泌量、杯狀細(xì)胞數(shù)量、淚液滲透壓值。
　　 結(jié)果：
　　 1.淚液分泌量的測(cè)定第0、7天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組的酚紅棉線浸濕長(zhǎng)度的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第14、28天，三組的酚紅棉線浸濕長(zhǎng)度的差異出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)

10、學(xué)意義(P<0.05)，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組酚紅棉線浸濕長(zhǎng)度顯著性下降，而HO組與HO+IO組兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 2.角膜熒光素染色與評(píng)分第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組角膜上皮熒光素染色均有少許點(diǎn)狀著色，三組之間角膜熒光素染色評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，HO組、HO+IO組角膜鼻側(cè)象限點(diǎn)狀著色增加，漸呈現(xiàn)片狀著色，病變逐漸發(fā)展累及角膜各個(gè)

11、象限，以角膜中央為重。第14天起，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組角膜熒光染色評(píng)分顯著上升。第14、28天，三組之間角膜熒光素染色評(píng)分出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)。
　　 3.淚液蕨類實(shí)驗(yàn)第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組BALB/c小鼠淚液在光學(xué)顯微鏡下可以觀察到形態(tài)良好的蕨類物。HO組、HO+IO組BALB/c小鼠淚液的結(jié)晶中蕨類物自第7天起逐漸減少，蕨類物之間的連接中斷。而同一時(shí)間點(diǎn)，HO+1%LC

12、A組較HO組、HO+IO組蕨類物形態(tài)保持良好。
　　 4.角膜上皮的HE染色觀察和角膜上皮厚度的測(cè)量第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組角膜HE染色觀察可見上皮分層良好，分4或5層，基底部的細(xì)胞呈柱狀排列，向角膜表層分化逐漸變成鱗狀上皮細(xì)胞，三組之間中央角膜厚度測(cè)量值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，HO組、HO+IO組角膜上皮表層細(xì)胞出現(xiàn)增生，細(xì)胞層數(shù)增多，角膜上皮厚度增加。第7天起，HO組、HO+IO組、

13、HO+1%LCA組三組之間中央角膜上皮厚度測(cè)量值出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)。第7、14、28天，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組中央角膜上皮層厚度明顯增加。
　　 5.結(jié)膜組織的PAS染色觀察和杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組結(jié)膜上穹窿部包含多層上皮細(xì)胞，形態(tài)呈圓柱狀或骰狀，杯狀細(xì)胞廣泛分布于穹窿部上皮細(xì)胞之間，三組之間結(jié)膜杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.538)。隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，HO組

14、、HO+IO組結(jié)膜上穹窿部上皮細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)缺失，杯狀細(xì)胞形態(tài)不一致，數(shù)量減少。第7天起，三組之間杯狀細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)。第7、14、28天，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)顯著性差異，而HO組與HO+IO組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 6.掃描電子顯微鏡觀察第0天，角膜表面上皮細(xì)胞的掃描電子顯微鏡觀察可見，上皮細(xì)胞呈多邊形，形態(tài)良好，細(xì)胞表面可見大量

15、微絨毛，細(xì)胞間緊密連接。第28天，HO組、HO+IO組絕大多數(shù)角膜表層細(xì)胞脫落，暴露第二層細(xì)胞，顯露膨脹的細(xì)胞核，微絨毛大量的脫落。第28天，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組角膜表面微絨毛明顯減少。
　　 7.淚液滲透壓測(cè)定建立BALB/c小鼠淚液滲透壓測(cè)定值轉(zhuǎn)化表。實(shí)驗(yàn)第0天，HO組、HO+IO組、HO+1%LCA組三組之間淚液滲透壓測(cè)定值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.712)。第28天，HO組、HO+IO組、HO+1%L

16、CA組三組之間淚液滲透壓測(cè)定值出現(xiàn)顯著性差異(P=0.000)，HO組、HO+IO組較HO+1%LCA組淚液滲透壓值升高，出現(xiàn)顯著性差異，而HO組與HO+IO組組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.局部應(yīng)用左卡尼汀具有減緩小鼠干眼模型眼表?yè)p害的作用。
　　 2.左卡尼汀可能通過滲透調(diào)節(jié)作用，對(duì)高滲鹽水誘導(dǎo)的小鼠干眼模型眼表起保護(hù)作用。
　　 3.局部應(yīng)用含左卡尼汀及其衍生物的