下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DMH)中TRPV4對寒冷刺激引起的大鼠戰(zhàn)栗性產(chǎn)熱的影響.pdf

1、前言：
　　 瞬時(shí)感受器電位(transientreceptorpotential,TRP)是近年來研究發(fā)現(xiàn)的與感覺功能有關(guān)的膜通道蛋白家族,在哺乳類動(dòng)物,TRRP家族可分為6個(gè)亞家族,包括TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPP及TRPML。TRPV4(又稱OTRPC4)是TRPV家族成員之一,是一種由871個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。在人類,其基因定位于12q24.1。NiliusB等研究表明,TRPV4在哺乳動(dòng)物組織中,

2、主要存在于心臟,大腦,內(nèi)皮,腎,感覺神經(jīng)元,交感神經(jīng),脂肪組織,腸,唾液腺,肺,皮膚,汗腺,內(nèi)耳和角質(zhì)形成細(xì)胞。原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示,在小鼠大腦TRPV4的表達(dá)部位在大腦的終板層,終板血管器的神經(jīng)元,視交叉,腹側(cè)的海馬聯(lián)合,下丘腦,側(cè)腦室脈絡(luò)叢的室管膜細(xì)胞和脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglia,DRG)神經(jīng)元中。
　　 TRPV4是一個(gè)非選擇性陽離子通道,激活時(shí)可產(chǎn)生較強(qiáng)的鈣離子內(nèi)流。2002年,Guler等用TRPV

3、4cDNA轉(zhuǎn)染非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopusoocyte)和人胚腎293細(xì)胞(humanembryonickidneyHEK293cell),研究發(fā)現(xiàn)TRPV4可感受低滲透壓刺激,并具有溫控特性,可被27℃以上的溫?zé)岽碳ぜせ?。TRPV4對溫?zé)岽碳さ姆磻?yīng)也可被釘紅抑制。
　　 恒溫動(dòng)物正常體溫的維持是在體溫調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)控下,產(chǎn)熱和散熱過程處于平衡。在寒冷刺激下,機(jī)體可通過戰(zhàn)栗產(chǎn)熱和非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱維持體熱平衡。非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱又稱代謝產(chǎn)熱,

4、主要有棕色脂肪組織和骨骼肌的非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱兩種形式。戰(zhàn)栗樣肌肉收縮是指在寒冷環(huán)境中,骨骼肌發(fā)生的不隨意的節(jié)律性收縮,其節(jié)律為9-11次/分。發(fā)生戰(zhàn)栗的肌肉在肌電圖上表現(xiàn)出成簇的高波幅集群放電,這是許多肌纖維同步化放電的結(jié)果。戰(zhàn)栗的特點(diǎn)是屈肌和伸肌同時(shí)收縮,所以不對外做功,產(chǎn)熱量很高。驅(qū)動(dòng)戰(zhàn)栗反應(yīng)的中樞在下丘腦背內(nèi)側(cè)核,該中樞發(fā)出的沖動(dòng)經(jīng)腦干脊髓外側(cè)束,下達(dá)到脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。這些沖動(dòng)能增加肌緊張,肌緊張一旦超過臨界水平,引起肌纖維收縮,就

5、出現(xiàn)具有明顯戰(zhàn)栗特征的節(jié)律性震顫。震顫速率可達(dá)10-20次/秒,其效率可在數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)使產(chǎn)熱提高許多倍。
　　 KojiShibasaki等研究證明,在海馬神經(jīng)元中存在的TRPV4通過影響其神經(jīng)元靜息電位水平,調(diào)控海馬神經(jīng)元的興奮性,進(jìn)而影響海馬神經(jīng)元的功能活動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)室以往的研究提示,下丘腦中的TRPV4參與維持正常體溫和LPS致大鼠發(fā)熱過程。因此推測下丘腦背內(nèi)側(cè)核中的TRPV4可能參與調(diào)控在寒冷刺激下引起的戰(zhàn)栗產(chǎn)熱。

6、>　　 本實(shí)驗(yàn)旨在探討下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DMH)中TRPV4參與體溫調(diào)節(jié)的中樞機(jī)制。應(yīng)用寒冷刺激下大鼠戰(zhàn)栗產(chǎn)熱的模型,結(jié)合在DMH給予TRPV4特異性激動(dòng)劑4-α-佛波醇-12,13-二葵酸(4-α-phorbol-12,13-didecanoate,4αPDD)或拮抗劑釕紅(rutheniumred),觀察在所設(shè)定的寒冷條件下動(dòng)物體溫的實(shí)時(shí)變動(dòng)情況,DMH中TRPV4表達(dá)量和細(xì)胞內(nèi)鈣含量,同時(shí)檢測發(fā)生戰(zhàn)栗時(shí)骨骼肌的肌電反應(yīng)強(qiáng)度。

7、>　　 方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及處理
　　 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
　　 選用健康雄性SD大鼠72只,體重220～250g,基礎(chǔ)體溫(38.1±0.2)℃,由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為6組,每組12只:正常對照組(N)、單純冷暴露組(C)、4aPDD組(P)、4aPDD+冷暴露組(P+C)、釕紅組(R)、釕紅+冷暴露組(R+C)。
　　 (2)大鼠DMH部位插管和發(fā)射子植入
　

8、　 下丘腦DMH插管:將大鼠用10%水合氯醛按每公斤體重3毫升腹腔麻醉,將其頭部固定于立體定位儀,切開皮膚,暴露出前囟。參照大鼠腦圖譜,向下丘腦DMH(B:-3.3mm,L/R:0.5mm,H:9mm),插入不銹鋼管,并留置與其相匹配的針芯,用牙托水加牙科水泥固定。
　　 檢測插管位置:試驗(yàn)結(jié)束后,向DMH中微量注射液體染料亞甲藍(lán)1微升。隨后用多聚甲醛經(jīng)大鼠心臟灌流,取出經(jīng)固定的大腦,并經(jīng)過30%蔗糖溶液中脫水后,制備冰凍切片

9、,顯微鏡下觀察插管位置,參照大鼠腦圖譜確定插管位置。
　　 無線遙感體溫發(fā)射子及肌電發(fā)射子植入:在麻醉狀態(tài)下,大鼠腹腔植入無線遙感系統(tǒng)發(fā)射子,并將金屬探頭埋入大鼠骨骼肌中。術(shù)后動(dòng)物單籠飼養(yǎng),恢復(fù)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2、體溫測量
　　 應(yīng)用BW-200生理無線遙測系統(tǒng)對大鼠體溫進(jìn)行測量。正式實(shí)驗(yàn)前一日早上8時(shí)開始記錄大鼠基礎(chǔ)體溫,每隔30分鐘測量體溫1次,共測量6小時(shí),取其平均值記為基礎(chǔ)體溫。實(shí)驗(yàn)均在早8時(shí)開始

10、,各組在相應(yīng)處理后開始監(jiān)測體溫變化,每隔5分鐘自動(dòng)記錄體溫一次,直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　 3、肌電測量
　　 應(yīng)用BW-200生理無線遙測系統(tǒng)測量大鼠骨骼肌肌電強(qiáng)度。
　　 4、下丘腦DMH細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)測定
　　 采用日立F-4500型熒光雙波長分光光度計(jì)測定。
　　 5、下丘腦DMH中TRPV4表達(dá)測定
　　 (1)Westernblot方法檢測下丘腦DMH中TRPV4

11、表達(dá)。對照選用抗β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin)。目的蛋白與相應(yīng)β-actin蛋白的灰度比值作為該目的蛋白的相對表達(dá)量。
　　 (2)免疫熒光檢測:DMH中TRPV4的表達(dá),并在熒光顯微鏡下觀察、攝片。
　　 6、數(shù)據(jù)分析
　　 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,應(yīng)用t檢驗(yàn)比較各組均數(shù)間的差異,相關(guān)分析用相關(guān)性檢驗(yàn)分析法。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對照組(N)比較,單純冷暴露組(C)

12、的體溫明顯下降;肌電的幅度降低;DMH中TRPV4表達(dá)增加,細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高。
　　 2.與單純冷暴露組(C)比較,預(yù)先給予4aPDD后進(jìn)行冷暴露(P+C),體溫明顯下降;肌電的強(qiáng)度降低;DMH中TRPV4蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度高于C組。
　　 3.與單純冷暴露組(C)比較,預(yù)先給予釕紅后進(jìn)行冷暴露(R+C),體溫與N組比較無明顯差別,但明顯高于C組;肌電的幅度也高于C組;DMH中TRPV4蛋白表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子