穹窿切斷對大鼠下丘腦室旁核CRH、AVP表達(dá)的影響.pdf

1、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)和精氨酸加壓素(AVP)對于促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)的合成和分泌是兩種主要的調(diào)節(jié)肽。CRH和AVP在人類和嚙齒類存在于下丘腦室旁核(PVN)。這兩種肽位于正中隆起神經(jīng)終末相同的分泌顆粒中，共同釋放入垂體門脈系統(tǒng)后，對腺垂體ACTH的分泌產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)。CRH和AVP調(diào)節(jié)系統(tǒng)可能幫助機(jī)體處理各種應(yīng)激事件。應(yīng)激反應(yīng)的主要特征是以下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA軸)激活為核心的生理和心理反應(yīng)。應(yīng)激后CRH

2、在HPA軸中發(fā)揮重要作用，控制著HPA軸的興奮水平。AVP能增加CRH對ACTH分泌釋放的調(diào)節(jié)作用。海馬不僅是應(yīng)激損傷的敏感區(qū)，而且還是HPA軸應(yīng)激反應(yīng)的高位反饋調(diào)節(jié)中樞。但是對于海馬如何調(diào)節(jié)下丘腦的機(jī)制還不十分清楚，本研究通過大鼠穹窿切斷模型，觀察穹窿切斷對大鼠下丘腦室旁核CRH和AVP表達(dá)的影響，探討海馬對HPA軸的抑制作用是否通過穹窿介導(dǎo)，為研究海馬調(diào)節(jié)下丘腦的機(jī)制提供理論和形態(tài)學(xué)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法: 1、實(shí)驗(yàn)動物及

3、分組成年健康雄性Wistar大鼠90只(由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)，隨機(jī)分為穹窿切斷0天、4天、7天、10天組及相應(yīng)的假手術(shù)組(只進(jìn)行手術(shù)切口，未切斷穹窿)和正常組，每組10只。 2、建立大鼠穹窿切斷模型大鼠經(jīng)2％戊巴比妥鈉麻醉后，固．定于腦立體定位儀(江灣IC型)，常規(guī)消毒，暴露出顱骨，于前囟后1.5mm，中線外左右各1.0mm處，用電動開顱器鉆開顱骨，用自制雙刃刀置于腦表面，接著降刀6mm(切斷穹窿)，假手術(shù)組降刀2m

4、m(未切斷穹窿)，刀在腦中停留5min。手術(shù)實(shí)施后在安靜條件下常規(guī)飼養(yǎng)，抗生素抗感染。 3、模型鑒定采用Kamovsky法染色顯示海馬CA1區(qū)膽堿能神經(jīng)纖維，每組每例隨機(jī)抽取3～4張切片，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察。 4、免疫組織化學(xué)方法(SABC)取正常組和術(shù)后0d、4d、7d、10d穹窿切斷組及相應(yīng)假手術(shù)組大鼠下丘腦行冰凍切片，分別用兔抗大鼠CRH(1∶500)和兔抗大鼠AVP(1∶1000)多克隆抗體進(jìn)行免疫細(xì)

5、胞化學(xué)染色，Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察、照相。同時，用替代法作陰性對照實(shí)驗(yàn)。 5、Western blotting檢測取各組新鮮大鼠下丘腦組織，勻漿粉碎后離心，取上清，加考馬斯亮藍(lán)染液測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)印，封閉，加一抗(CRH1∶1000；AVP1∶2000)4℃過夜，HRP標(biāo)記IgG(1∶1500)2h，DAB法顯色10 min，DH<,2>O漂洗，PVDF膜常溫晾干后進(jìn)行定量檢測。 6、

6、圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)，每張切片選2個視野，計(jì)算各組平均光密度(IOD)值。Western blotting結(jié)果圖像掃描后分析各條帶的灰度值。SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用x±s表示，各組之間進(jìn)行方差分析，p<0.05表示有顯著性差異。 結(jié)論: 穹窿切斷使下丘腦室旁核CRH和AVP表達(dá)升高，HPA軸活動增強(qiáng)，海馬對HPA軸的抑制作用減弱，提示海馬