高糖對大鼠DRG中TRPV4通道的影響.pdf

1、痛性糖尿病周圍神經(jīng)病變(painful diabetic neuropathy，PDN)是逐漸被認識的糖尿病最常見的并發(fā)癥之一。PDN的主要臨床癥狀是自發(fā)性疼痛、痛覺過敏、上下肢對稱性疼痛等神經(jīng)病理性疼痛，患者可能出現(xiàn)劇烈的肢體疼痛，還伴隨睡眠障礙及抑郁，甚至導致足部潰瘍或截肢，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，同時也是糖尿病患者致死致殘的主要因素。因為感覺異常往往是PDN的首發(fā)癥狀，背根神經(jīng)節(jié)(DRG)富含感覺神經(jīng)元，代謝水平高，自主調(diào)控時對局

2、部血流變化非常敏感，在解剖學上不受血腦屏障和血神經(jīng)屏障的保護，所以DRG神經(jīng)元在糖尿病狀態(tài)下有明顯的易感性。已有許多的研究報告表明在鏈脲霉素引起的糖尿病大鼠DRG神經(jīng)元或培養(yǎng)的糖尿病大鼠DRG神經(jīng)元存在神經(jīng)元凋亡。TRPV4通道在DRG神經(jīng)元上高表達，并且在DRG神經(jīng)元受到持續(xù)壓迫后機體產(chǎn)生各種傷害性感覺及神經(jīng)性疼痛的傳導過程中發(fā)揮著關鍵的作用，TRPV4通道被激活后可導致Ca2+內(nèi)流，使神經(jīng)元內(nèi)鈣超載。但是TRPV4通道是否參與了PD

3、N的形成尚未有報道。蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)是TRPV4的刺激因子之一，是細胞內(nèi)信號轉導重要物質(zhì)，在糖尿病狀態(tài)下DAG代謝量增多，PKCε進而被激活。所以本實驗在細胞水平研究高糖對DRG神經(jīng)元上TRPV4通道的影響，明確葡萄糖/DAG-PKCε/TRPV4、Ca2+在PDN形成及發(fā)展過程中是如何發(fā)揮作用的。
　　 材料與方法
　　 原代培養(yǎng)的新生大鼠DRG神經(jīng)元，不同糖濃度處理24 h

4、、48 h、72 h，采用MTT法和LDH試劑盒檢測DRG神經(jīng)元的生存率和LDH的生成量。不同糖濃度組分別設為空白組和Enzasturin處理24 h組，用ELISA方法檢測DRG神經(jīng)元內(nèi)的DAG含量。不同糖濃度組的DRG神經(jīng)元，采用全細胞膜片鉗檢測TRPV4通道的電流密度及其電流密度的改變，采用共聚焦顯微鏡檢測DRG神經(jīng)元內(nèi)的游離鈣離子含量及其改變。
　　 結果
　　 1、不同葡萄糖濃度對DRG神經(jīng)元生存率和LDH生成

5、的影響
　　 葡萄糖濃度5.5、11.0、17.5、25.0、35.0、50.0(mM)培養(yǎng)DRG神經(jīng)元24 h、48 h、72 h，隨葡萄糖濃度的增高，DRG神經(jīng)元相對生存率降低，LDH的生成增多，同時表現(xiàn)為時間和劑量依賴性。根據(jù)MTT和LDH的結果最終確定，培養(yǎng)DRG神經(jīng)元的葡萄糖濃度分別為C組:5.5mM、M組:17.5 mM、H組:35.0 mM，培養(yǎng)時間為48 h。DRG神經(jīng)元培養(yǎng)48 h后，在糖濃度為17.5 mM和

6、35.0 mM時，神經(jīng)元生存率(％)分別為0.87±0.06和0.73±0.07，LDH的生成量分別為181.00±18.86和233.33±23.08。在細胞形態(tài)上，DRG神經(jīng)元在生長過程中貼壁不良，邊緣不清晰等現(xiàn)象，使DRG神經(jīng)元失去正常生長狀態(tài)。
　　 2、DRG神經(jīng)元內(nèi)DAG含量的檢測
　　 空白組與給藥組中，不同葡萄糖濃度培養(yǎng)后與C組相比，M組和H組DAG的含量增加，H組更顯著(P＜0.01)。在葡萄糖濃度相同

7、時，DAG含量的空白組低于給藥組(P＜0.05)。
　　 3、激光共聚焦顯微鏡檢測DRG神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i
　　 記錄到不同糖濃度下DRG神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度，分別為(nM)C:161.53±5.47、M:191.53±4.01、H:282.21±8.64。TRPV4通道的激動劑4α-PDD可以濃度依賴性地引起[Ca2+]i增加，去除溶液中的鈣，細胞對4α-PDD的反應喪失。與C組相比，4α-PDD引起的M組和H組鈣濃

8、度升高的幅度和峰值明顯增加(P＜0.01)。Enzastaurin可以顯著降低DRG神經(jīng)元內(nèi)鈣離子濃度，抑制率(％)分別為C:47.51、M:57.04、H:60.70。然而，在先給予Enzastaurin后，DRG神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i水平基本沒有改變，進一步給4α-PDD，DRG神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i水平升高的幅度顯著變小，甚至出現(xiàn)下降。
　　 4、DRG神經(jīng)元TRPV4通道電流的檢測
　　 DRG神經(jīng)元的電容(pF

9、)，C組:21.04±2.19;M組:23.70±2.37;H組:25.71土3.34。
　　 ITRPV4(pA/pF),C組，-100 mV:-3.38±0.74,+100mV:5.99±0.68;M組，-100mV:-8.63±1.3,+100mV:10.82±0.88;H組，-100 mV:-9.27±2.16,+100 mV:12.29±1.77。M組和H組較C組的TRPV4通道的電流密度顯著升高(P＜0.05)。

10、r>　　 TRPV4通道激動劑可以使M組、H組ITRPV4顯著增強，激活率分別為(％)C:185.59、M:202.67、H:312.60。然而TRPV4通道激活后產(chǎn)生的電流又可以被PKCε特異性抑制劑Enzastaurin所抑制，抑制率(％)分別為C:14.61、M:27.40、H:42.90;PKCε特異性抑制劑Enzastaurin可以抑制ITRPV4，但是不能被TRPV4通道激動劑重新激活。
　　 結論：
　　

11、 1、高糖使TRPV4通道功能增強，導致DRG神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i升高。
　　 2、DRG神經(jīng)元內(nèi)[Ca2+]i的升高是由TRPV4通道介導的，TRPV4通道的活性依賴于PKCε的激活，而PKCε又受到DAG的調(diào)控。
　　 3、PDN的形成機制可能與以下因素有關，即神經(jīng)元內(nèi)過多的葡萄糖引起DAG合成增加，導致神經(jīng)元內(nèi)DAG含量升高，進而激活PKCε，并且協(xié)助PKCε由胞漿轉移到細胞膜，進而調(diào)節(jié)和激活TRPV4通道，導致