十溴聯(lián)苯乙烷肝毒性及肝代謝機(jī)制初步研究.pdf

1、【目的】十溴聯(lián)苯乙烷(Decabromodiphenyl ethane,DBDPE)作為多溴聯(lián)苯醚類(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)阻燃劑的替代品于上世紀(jì)90年代進(jìn)入市場,由于其高分子量和低脂溶性,在很長一段時(shí)間內(nèi)被認(rèn)為難以釋放到環(huán)境中、難以被生物降解和利用。2003年,DBDPE首次在淤泥中被檢出,隨后被從室內(nèi)空氣、污水等介質(zhì)和生物體內(nèi)檢出,表明DBDPE與其結(jié)構(gòu)類似物十溴聯(lián)苯醚(Decab

2、romodiphenyl ether,BDE-209)一樣,可以進(jìn)入環(huán)境,并可在環(huán)境、食物鏈以及生物體內(nèi)發(fā)生蓄積。相關(guān)研究顯示,DBDPE人群環(huán)境暴露水平持續(xù)增加,人體蓄積水平呈現(xiàn)較快增加趨勢。因此有必要開展DBDPE對(duì)生物體的潛在健康危害研究。目前針對(duì)DBDPE的毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究開展的比較少。Hardy等開展的嚙齒類動(dòng)物和水生生物毒性研究表明,DBDPE難以被生物體降解,健康危害風(fēng)險(xiǎn)水平低。Nakari等采用水生生物開展的毒性研究表明,

3、DBDPE可被水生生物降解,并對(duì)水生生物具有急性毒性、雌激素樣作用及生殖毒性,但其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)存在一定的缺陷,研究中采用甲苯作為溶劑。此外,目前對(duì)DBDPE的代謝和毒作用機(jī)制也尚不清楚,而DBDPE的結(jié)構(gòu)類似物PBDEs可作用于機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)受體,干擾機(jī)體內(nèi)分泌系統(tǒng)和代謝平衡?；谝验_展研究之間的結(jié)果差異和DBDPE結(jié)構(gòu)類似物的毒理學(xué)特征、毒作用機(jī)制,結(jié)合肝代謝在溴化阻燃劑(bromoniated flame retardants,BF

4、Rs)毒性作用中的關(guān)鍵作用,本研究開展了DBDPE的肝毒性和肝代謝機(jī)制研究,以期解決目前研究中存在的問題,獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),為開展進(jìn)一步研究提供可靠的研究基礎(chǔ)和指明方向。
　　【內(nèi)容和方法】參考DBDPE結(jié)構(gòu)類似物BDE-209的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),本研究首先選用人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象;采用0-100mg/LDBDPE作為HepG2細(xì)胞染毒劑量,選擇二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)作為DBDPE

5、溶劑配制系列染毒液,DMSO在染毒液中濃度保持0.5％(V/V);染毒時(shí)間為24h、48h和72h。染毒結(jié)束后,采用噻唑藍(lán)(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)實(shí)驗(yàn)和L-乳酸脫氫酶(L-Lactic dehydrogenase,LDH)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)細(xì)胞存活率和細(xì)胞損傷情況進(jìn)行測定;采用Hoechst33258染料對(duì)染毒后細(xì)胞染色,倒置熒光顯微

6、鏡下觀察、記錄細(xì)胞變化和損傷程度;采用碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色-流式細(xì)胞儀檢測方法測定細(xì)胞凋亡情況;為探究細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡機(jī)制,本研究測定了染毒后活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量;為驗(yàn)證ROS與細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡的關(guān)系,染毒前在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入ROS清除劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC),染毒結(jié)束后,采用MTT實(shí)驗(yàn)和PI染色-流式

7、細(xì)胞儀檢測方法分別測定細(xì)胞存活率和凋亡情況,分析NAC加入前后ROS生成、細(xì)胞存活率和凋亡變化情況,以驗(yàn)證ROS與細(xì)胞損傷的關(guān)系。
　　本研究選擇Wistar大鼠作為染毒對(duì)象,選擇購自美國雅寶公司的商品化DBDPE產(chǎn)品(DBDPE純度≥98.5%)作為染毒化合物,參照已開展研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),設(shè)置染毒劑量為0-1000mg/kg/d,選擇經(jīng)口染毒方式;染毒28天后,測定Wistar大鼠體重、肝臟重量、臟器系數(shù)和肝臟功能性損傷生化指標(biāo),探

8、討DBDPE對(duì)肝臟的損傷情況;考慮到細(xì)胞毒性研究中DBDPE可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS含量增加,對(duì)相關(guān)的谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)等氧化損傷指標(biāo)進(jìn)行了測定,以期在動(dòng)物水平驗(yàn)證氧化損傷與肝臟毒性的關(guān)系。此外

9、,本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real time-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)對(duì)不同染毒劑量組的大鼠肝臟多種相關(guān)的細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)在mRNA水平進(jìn)行了測定;進(jìn)而采用Westernblot實(shí)驗(yàn)對(duì)mRNA水平發(fā)生顯著改變的CYP450酶在蛋白水平進(jìn)行了測定;采用超高速離心技術(shù)獲得大鼠肝臟微粒體,對(duì)CYP2B酶對(duì)應(yīng)的PROD(pentoxyr

10、esorufin O-dealkylation)、CYP3A酶對(duì)應(yīng)的LBD(Luciferin benzylether debenzylase)和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(Uridinediphosphate-glucuronosyltransferase,UDPGT)活性進(jìn)行了測定,以分析和推斷DBDPE在肝臟中的代謝情況和作用機(jī)制。
　　【結(jié)果】在HepG2細(xì)胞毒性研究實(shí)驗(yàn)部分,利用0-100.0mg/LDBDPE對(duì)HepG

11、2細(xì)胞染毒24h、48h和72h,MTT實(shí)驗(yàn)、LDH實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)表明,DMSO對(duì)細(xì)胞存活率、細(xì)胞損傷程度以及Hoechst33258染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響與對(duì)照組之間無顯著性差異;0-6.25mg/L劑量染毒24h、48h和72h后細(xì)胞存活率、細(xì)胞損傷程度以及細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變與對(duì)照組相比無顯著性差異;12.5-100.0mg/L劑量染毒48h和72h可降低細(xì)胞存活率、增加細(xì)胞損傷程度和引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯著改變,具有明顯的時(shí)間和

12、劑量-反應(yīng)關(guān)系;PI染色-流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),12.5-100mg/L劑量DBDPE可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡,存在時(shí)間和劑量-反應(yīng)關(guān)系;研究還發(fā)現(xiàn),DBDPE可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞ROS生成量增加,通過NAC驗(yàn)證試驗(yàn),證實(shí)DBDPE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和損傷與ROS有關(guān)。
　　在DBDPE對(duì)Wistar大鼠染毒動(dòng)物毒性研究中,采用0-1000mg/kg劑量DBDPE對(duì)Wistar大鼠連續(xù)經(jīng)口染毒28天后發(fā)現(xiàn),DBDPE染毒后Wistar大

13、鼠體重、肝臟重量、臟器系數(shù)等指標(biāo)與對(duì)照組相比,無顯著性差異;血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),較高劑量組DBDPE可誘導(dǎo)雄性Wistar大鼠乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic pyruvic transaminase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase,AST)、膽汁酸(Total bile acid,TBA)、總膽紅素(total bilirubin,TBA)和

14、葡萄糖(Glucose,Glu)的顯著改變,部分劑量組還可誘導(dǎo)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(glutamyl transpeptidase,GGT)、血漿總蛋白(Total protein,TP)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、尿素氮(urea nitrogen,UN)和肌酐(Creatinine,Cr)的顯著改變;此外,較高劑量組DBDPE還可誘導(dǎo)雌性Wistar大鼠堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)、A

15、ST和Glu的顯著改變,部分劑量組還可誘導(dǎo)TBA、Cr和TG的顯著改變。此外,中高DBDPE染毒劑量組GSH水平與對(duì)照組存在顯著性差異,結(jié)合DBDPE可致HepG2細(xì)胞ROS生成量增加,提示DBDPE可能致肝臟發(fā)生氧化損傷。上述結(jié)果表明,DBDPE對(duì)大鼠具有肝毒性,可引起肝損傷,還可影響大鼠膽汁排泄等功能和正常糖等的代謝,且相關(guān)研究結(jié)果提示DBDPE可能干擾肝臟脂肪和蛋白的代謝,分析DBDPE可能具有一定的內(nèi)分泌干擾作用,可能通過干擾機(jī)

16、體內(nèi)分泌途徑,啟動(dòng)機(jī)體某些信號(hào)通路,干擾機(jī)體正常代謝功能;還可能通過氧化損傷等作用引起肝損傷,進(jìn)而引起代謝功能受損。
　　DBDPE對(duì)Wistar大鼠染毒后,肝CYP450代謝酶mRNA、蛋白和酶活性檢測發(fā)現(xiàn),染毒組CYP1A1/2mRNA與對(duì)照組相比無顯著性差異,提示DBDPE可能具有較低或無二噁英樣毒性作用;CYP2B1和CYP3A1/3mRNA與對(duì)照組相比無顯著性差異;雄性大鼠CYP2B2、CYP3A2在三個(gè)水平上,較高劑量

17、組與對(duì)照組相比存在顯著差異;雌性大鼠CYP2B2、CYP3A2在三個(gè)水平上,個(gè)別劑量組與對(duì)照組相比存在顯著差異;UDPGT活性檢測表明,較高劑量組DBDPE對(duì)雄性大鼠UDPGT活性具有誘導(dǎo)作用,并具有一定的劑量反應(yīng)關(guān)系;僅500mg/kg.d劑量組DBDPE對(duì)雌性大鼠UDPGT活性的影響與對(duì)照組存在顯著性差異。據(jù)此推測DBDPE對(duì)Wistar大鼠代謝酶的影響存在一定的性別差異,對(duì)雄性Wistar大鼠影響較大;分析認(rèn)為DBDPE可能通過激

18、活組成型雄烷受體(constitutive androstane receptor,CAR)和孕烷X受體(pregnane xenobiotic receptor,PXR)信號(hào)通路,進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶對(duì)DBDPE進(jìn)行代謝以及干擾Wistar大鼠內(nèi)分泌系統(tǒng),影響Wistar大鼠體內(nèi)正常代謝穩(wěn)態(tài),發(fā)揮毒性作用。
　　【結(jié)論】DBDPE具有一定的肝毒性,ROS和氧化損傷分別在肝細(xì)胞毒性和大鼠肝損傷中發(fā)揮重要作用;DBDPE可能