RB94基因在非小細(xì)胞肺癌治療中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是當(dāng)前對(duì)人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一，發(fā)病率一直在不斷上升，并已成為目前人類癌癥死亡的主要原因，五年生存率約為15％。肺癌包括非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lungcaner, SCLC)，其中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85％。非小細(xì)胞肺癌主要包括鱗癌（Squamous cell carcinoma，SCC）和腺癌(adeno

2、carcinoma，ADC)。目前，肺癌的治療手段主要包括手術(shù)、放療、化療、生物免疫治療等，雖然肺癌的治療手段較以前有了很大的提高，但是臨床就診的NSCLC中，絕大部分已屬于中晚期，失去治療的最佳時(shí)機(jī)，因此，積極尋找有效治療NSCLC的新方法是臨床上急需解決的難題。
　　隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的深入研究，對(duì)肺癌的病因和發(fā)生機(jī)制也有了更深的認(rèn)識(shí)，肺癌的發(fā)生和其他腫瘤一樣，其實(shí)質(zhì)是基因異常的結(jié)果。許多致癌因素均可通過(guò)激活原癌基因和

3、/或失活抑癌基因而使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化和癌變。因此，基因治療越來(lái)越受到腫瘤學(xué)家的關(guān)注。而如何選取高效的基因治療的靶點(diǎn)成了又一難題。RB94基因?yàn)橐吧蚏B110的N末端缺失112個(gè)氨基酸殘基，編碼分子量為94KD的抑癌蛋白，比RB110表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑癌作用。且不易被磷酸化，半衰期長(zhǎng)，在細(xì)胞內(nèi)較穩(wěn)定存在。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腺病毒介導(dǎo)的RB94基因感染頭頸部癌，膀胱癌及前列腺癌細(xì)胞系及體內(nèi)腫瘤均表現(xiàn)出顯著的腫瘤抑制效應(yīng)。而且，RB94基因聯(lián)合放療能夠協(xié)

4、同抑制頭頸部腫瘤和肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此，RB94基因也許能成為有效治療非小細(xì)胞肺癌的基因靶點(diǎn)。
　　前期課題組成員構(gòu)建了含有RB94基因的質(zhì)粒pIRES-RB94，轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞和肺腺癌裸鼠皮下移植瘤，研究發(fā)現(xiàn)，RB94基因無(wú)論對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞系還是裸鼠移植瘤均具有明顯的腫瘤抑制作用。鞘氨醇激酶(sphingosinekinase，SphK)能夠催化鞘氨醇(sphingomyelin，SP)生成1-磷酸鞘氨醇(sphi

5、ngosinel-phosphate，S1P)，鞘氨醇激酶含有SphK1和SphK2兩個(gè)亞基。SphK1能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制細(xì)胞的凋亡;SphK2與SphK1作用相反，能夠抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。RB94基因可以抑制鞘氨醇激酶1(sphingosinekinase1，SphK1)的表達(dá)、增強(qiáng)鞘氨醇激酶2(sphingosine kinase2，SphK2)的表達(dá)，推測(cè)RB94基因?qū)δ[瘤的抑制作用可能通過(guò)鞘氨醇激酶的作用，干預(yù)S

6、phk1/S1P通路，使鞘磷脂的代謝通路作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。
　　本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，利用gateway技術(shù)構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的含有RB94基因的重組腺病毒載體Ad-RB94，進(jìn)一步利用含有RB94基因的腺病毒載體感染肺腺癌A549細(xì)胞和人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549裸鼠皮下移植瘤，分別在細(xì)胞水平和動(dòng)物水平研究RB94基因在非小細(xì)胞肺癌治療中的作用及機(jī)制。
　　

7、本課題分為三大部分。第一部分:利用gateway技術(shù)構(gòu)建含有RB94基因的重組腺病毒載體Ad-RB94;第二部分:RB94基因?qū)θ朔蜗侔〢549細(xì)胞周期調(diào)控作用及SphKs表達(dá)的影響;第三部分:RB94基因?qū)Ψ蜗侔┞闶笃は乱浦擦龅纳L(zhǎng)抑制作用及SphKs表達(dá)的影響。
　　第一部分利用Gateway技術(shù)構(gòu)建含有RB94基因的重組腺病毒載體
　　目的:獲得RB94基因，構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的人RB94基因的重組腺病毒載

8、體Ad-RB94，為下一步在細(xì)胞和動(dòng)物水平研究RB94基因奠定基礎(chǔ)。方法:運(yùn)用PCR方法擴(kuò)增目的基因RB94全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)含有attB側(cè)翼序列引物，用于重組片段的PCR擴(kuò)增，利用Gateway技術(shù)，在BP重組酶的作用下，將含attB位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與帶有綠色熒光蛋白(GFP)的載體發(fā)生重組反應(yīng)。在LR重組酶作用下，將攜帶目的基因及綠色熒光蛋白的載體與帶attR1、attR2位點(diǎn)的載體Ad/CMV/V5-DEST體外重組形成腺病毒載體Ad-R

9、B94。經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定，將Ad-RB94線性化后轉(zhuǎn)入293A細(xì)胞進(jìn)行病毒的包裝、擴(kuò)增及病毒滴度測(cè)定。
　　結(jié)果:經(jīng)酶切及基因測(cè)序鑒定證實(shí)重組腺病毒載體Ad-RB94構(gòu)建成功。攜帶綠色熒光的腺病毒載體Ad-RB94在293細(xì)胞中包裝成功，在熒光顯微鏡下，可以觀察到轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的綠色熒光，獲得高滴度的病毒顆粒，病毒滴度可達(dá)2×109pfu/ml。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建重組腺病毒Ad-RB94，為下一步在細(xì)胞和動(dòng)物

10、水平進(jìn)行腫瘤基因治療研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二部分 RB94基因?qū)θ朔蜗侔〢549細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的:研究RB94基因?qū)θ朔蜗侔〢549細(xì)胞周期調(diào)控作用及SphKs表達(dá)的影響。
　　方法:利用Gateway技術(shù)成功構(gòu)建的重組腺病毒載體Ad-RB94感染肺腺癌細(xì)胞株A549，GFP檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR、Westernblot技術(shù)檢測(cè)感染A549細(xì)胞前后RB94基因的mRNA和蛋白水平變化;流式細(xì)胞儀(

11、FCM)分析細(xì)胞周期;RT-PCR和細(xì)胞免疫熒光測(cè)定重組腺病毒Ad-RB94感染A549細(xì)胞前后RB94基因?qū)549細(xì)胞中SphKs基因含量的影響。
　　結(jié)果:流式細(xì)胞儀測(cè)定結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組和空載體組相比，感染腺病毒Ad-RB94組，G2/M期細(xì)胞數(shù)目增加，而G0/G1和S期細(xì)胞數(shù)目減少，Real timePCR和細(xì)胞免疫熒光均顯示:RB94基因能夠抑制SphK1表達(dá)、增強(qiáng)SphK2表達(dá)。
　　結(jié)論:RB94基因可使

12、阻滯于G2/M期細(xì)胞數(shù)目增加。同時(shí)，RB94基因可抑制A549細(xì)胞中SphK1的表達(dá)、增強(qiáng)SphK2的表達(dá)。
　　第三部分 RB94基因的對(duì)肺腺癌裸鼠皮下移植瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的;研究RB94基因?qū)Ψ蜗侔〢549細(xì)胞裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)的抑制作用及SphKs表達(dá)的影響。
　　方法:采用皮下接種人肺腺癌A549細(xì)胞懸液的方法構(gòu)建裸鼠種植瘤模型，Realtime PCR檢測(cè)RB94基因在裸鼠瘤組織的表達(dá)，觀察RB94

13、基因?qū)Ψ蜗侔┞闶笃は乱浦擦龅纳L(zhǎng)抑制作用。Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Real time RT-PCR和組織免疫熒光檢測(cè)重組腺病毒Ad-RB94注射后RB94基因?qū)β闶竽[瘤中SphKs基因表達(dá)含量的影響。
　　結(jié)果:與空白對(duì)照組、空載體組相比，注射腺病毒Ad-RB94組的裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度明顯減慢，腫瘤的體積明顯減低(P＜0.05)，抑瘤率達(dá)60.5％。注射腺病毒Ad-RB94組的細(xì)胞凋亡率為26％，Real time