CD47在非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移中的作用及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:肺癌在我國(guó)發(fā)病率極高，據(jù)報(bào)道近十幾年肺癌分別占在我國(guó)男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一和第二位，并且發(fā)病年齡也出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。其中非小細(xì)胞肺癌作為肺癌的一個(gè)大類發(fā)病率也逐年增高，近年來肺癌相關(guān)領(lǐng)域基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究及臨床診斷治療方法逐漸進(jìn)步，越來越多的肺癌患者得到了規(guī)范的治療，使得肺癌的診治率有了很大的提升，然而由于肺癌表現(xiàn)出較強(qiáng)的侵襲性，尤其是一旦肺癌發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者即將面臨極高的死亡威脅。因此，總體來說，對(duì)肺癌的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行控制仍

2、然是肺癌領(lǐng)域需要解決的重要關(guān)鍵問題。然而目前腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制仍不清楚。
　　為了探索腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機(jī)制，近年來，CD47分子逐漸引起了大家的關(guān)注。其重要原因在于，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)“別吃我”信號(hào)，從而使得巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤吞噬作用減低，出現(xiàn)腫瘤對(duì)免疫逃逸現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。而腫瘤細(xì)胞高表達(dá)的CD47分子就是一種“別吃我”信號(hào)分子。當(dāng)腫瘤細(xì)胞表面CD47分子與巨噬細(xì)胞的表面SIRPα分子組合成CD47-SIR

3、Pα信號(hào)復(fù)合體時(shí)，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞SIRPα分子的細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)發(fā)生磷酸化，因此可以傳導(dǎo)抑制性信號(hào)通路，即“別吃我”信號(hào)來減少巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬活性，這樣便產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸現(xiàn)象。而且CD47高水平表達(dá)與血液系統(tǒng)惡性腫瘤和部分實(shí)體腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移能力、生存率及預(yù)后密切相關(guān)。CD47與腫瘤相關(guān)性研究得到越來越多關(guān)注，然而CD47在肺癌表達(dá)及與轉(zhuǎn)移的相關(guān)性等研究未見相關(guān)報(bào)道。另一方面，除了研究者關(guān)

4、注的CD47-SIRPα信號(hào)復(fù)合體引起的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象，另有研究者提出CD47與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用仍有其他機(jī)制參與其中，然而相關(guān)的機(jī)制研究甚少。因此，本研究亦將對(duì)CD47與轉(zhuǎn)移的相關(guān)作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。我們通過組織標(biāo)本和肺癌細(xì)胞株的CD47表達(dá)情況進(jìn)行分別檢測(cè)，并利用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分別對(duì)CD47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性進(jìn)行分析驗(yàn)證。最后對(duì)CD47與肺癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探討。本研究分以下三部分進(jìn)行。
　　研究方法:1.非小細(xì)

5、胞肺癌組織CD47的表達(dá)及其臨床意義
　　選取20例非小細(xì)胞肺癌者切除的手術(shù)標(biāo)本，利用western blotting方法對(duì)癌及癌旁組織中的CD47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)80例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟組織切片對(duì)CD47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，通過免疫組織化學(xué)評(píng)分將80例患者按照CD47表達(dá)水平分為低表達(dá)CD47組和高表達(dá)CD47組，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的方法對(duì)不同CD47表達(dá)水平與病理分型、腫瘤分化程度及TNM分期等臨

6、床病理特征進(jìn)行分析。
　　2.CD47在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用
　　本部分研究分別從體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面進(jìn)行闡述。體外實(shí)驗(yàn)部分:首先利用western blot、real-time PCR和細(xì)胞免疫熒光對(duì)不同肺癌細(xì)胞株的CD47表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。為驗(yàn)證CD47表達(dá)水平與細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，我們構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以對(duì)細(xì)胞在不同情況下的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)觀察。利用RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒

7、轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520的CD47表達(dá)，將進(jìn)行不同處理的各組細(xì)胞株分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)觀察72小時(shí)后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況，分析不同CD47表達(dá)水平表現(xiàn)出的肺癌細(xì)胞體外轉(zhuǎn)移能力的差異和區(qū)別。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:通過皮下注射構(gòu)建原位肺癌模型、通過尾靜脈注射構(gòu)建肺癌移植模型，同時(shí)利用shRNA穩(wěn)定下調(diào)A549細(xì)胞的CD47表達(dá)，觀察在兩種動(dòng)物模型中不同CD47表達(dá)的A549細(xì)胞的原位成瘤以及腫瘤轉(zhuǎn)移

8、情況，進(jìn)一步驗(yàn)證CD47與肺癌發(fā)展轉(zhuǎn)移的影響。
　　3.CD47促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步探討
　　為探討Cdc42作為CD47的下游分子參與非小細(xì)胞肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移我們進(jìn)行以下研究，利用western blot方法檢測(cè)不同肺癌細(xì)胞株CD47和Cdc42的表達(dá)情況;通過RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)分別下調(diào)或上調(diào)肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520的CD47表達(dá)，進(jìn)一步觀察CD47表達(dá)水平變化是否伴隨Cdc42

9、表達(dá)改變。上調(diào)CD47表達(dá)的A549和NCI-H520細(xì)胞株再利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Cdc42表達(dá)后觀察不同處理情況的細(xì)胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺(tái)內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的情況。最后對(duì)80例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟切片CD47表達(dá)與Cdc42表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:1.非小細(xì)胞肺癌組織CD47的表達(dá)及其臨床意義
　　利用western blotting蛋白檢測(cè)方法對(duì)20例非小細(xì)胞肺癌患者的手術(shù)切除組織標(biāo)本的癌及癌旁組織中CD47

10、表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)癌組織的CD47表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。同時(shí)采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法對(duì)80例非小細(xì)胞肺癌患者的石蠟切片對(duì)CD47表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果亦證實(shí)癌組織CD47表達(dá)明顯高于癌旁組織，對(duì)不同患者的CD47表達(dá)水平進(jìn)行分組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CD47與TNM分期密切相關(guān)，高表達(dá)CD47的患者更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;另外高表達(dá)CD47與臨床分期亦相關(guān)，高表達(dá)CD47的患者臨床分期越差。提過提示CD47表達(dá)水平

11、與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)，對(duì)CD47的表達(dá)檢測(cè)將對(duì)臨床轉(zhuǎn)移和預(yù)后的判斷具有重要意義。
　　2.CD47在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用
　　為了在體外觀察驗(yàn)證細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，我們成功構(gòu)建了基于微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型。利用該模型我們可以實(shí)時(shí)對(duì)不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。為了更加全面驗(yàn)證的CD47在NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，我們分別選取了肺腺癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520分別進(jìn)行檢測(cè)分析。利用RNA

12、干擾技術(shù)成功將A549和NCI-H520的CD47表達(dá)水平下調(diào)，進(jìn)而將未處理和下調(diào)CD47表達(dá)的A549和NCI-H520細(xì)胞分別注入微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)，觀察72小時(shí)后細(xì)胞的轉(zhuǎn)移情況，結(jié)果證實(shí)在下調(diào)CD47表達(dá)的A549和NCI-H520細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量較對(duì)照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。為進(jìn)一步驗(yàn)證，我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549和NCI-H520細(xì)胞穩(wěn)定上調(diào)CD47表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上調(diào)CD47表達(dá)后A549和NCI-H52

13、0的細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察，穩(wěn)定下調(diào)CD47表達(dá)的A549組6只裸鼠的皮下成瘤體積大小較A549組明顯減小;在尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型小鼠中同樣觀察到穩(wěn)定下調(diào)CD47表達(dá)的A549組形成的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量少于A549組。
　　3.CD47促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的初步探討
　　通過western blot檢測(cè)了不同肺癌細(xì)胞株CD47蛋白表達(dá)與Cdc42蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)C

14、D47的細(xì)胞株中Cdc42也呈高表達(dá)，反之亦然。為驗(yàn)證Cdc42作為CD47的下游分子參與了肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，我們對(duì)A549和NCI-H520分別下調(diào)或上調(diào)CD47表達(dá)，利用western blot檢測(cè)了Cdc42的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明CD47表達(dá)水平的變化伴隨了Cdc42表達(dá)水平的改變。對(duì)80例肺癌患者對(duì)組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色觀察，發(fā)現(xiàn)在高表達(dá)CD47的患者中80.4％也存在Cdc42高表達(dá);在低表達(dá)CD47的患者中85.

15、3％也存在Cdc42低表達(dá)。表明CD47表達(dá)調(diào)節(jié)了Cdc42的表達(dá)情況。為進(jìn)一步驗(yàn)證CD47通過Cdc42調(diào)節(jié)細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，我們利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549和NCI-H520上調(diào)CD47的表達(dá)，再利用RNA干擾技術(shù)下調(diào)Cdc42表達(dá)，在微流控芯片轉(zhuǎn)移平臺(tái)內(nèi)觀察下調(diào)Cdc42表達(dá)后細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量較未下調(diào)Cdc42表達(dá)的對(duì)照組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1.通過western blot和免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

16、到非小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本的CD47表達(dá)癌組織明顯高于癌旁組織;CD47表達(dá)與患者轉(zhuǎn)移情況、臨床分期相關(guān)，高表達(dá)CD47的患者臨床分期越差、更易出現(xiàn)淋巴轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此提示CD47分子可以在非小細(xì)胞肺癌中判斷侵襲和轉(zhuǎn)移的一個(gè)指標(biāo)。
　　2.成功構(gòu)建了可以模擬細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程的微流控芯片轉(zhuǎn)移模型。在該芯片模型內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)并對(duì)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移數(shù)量進(jìn)行實(shí)時(shí)的動(dòng)態(tài)觀察，通過比較轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)量的差別來直觀驗(yàn)證細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力。采用肺腺

17、癌細(xì)胞株A549和肺鱗癌細(xì)胞株NCI-H520作為研究對(duì)象，利用RNA干擾技術(shù)和質(zhì)粒表達(dá)下調(diào)和上調(diào)兩種細(xì)胞株的CD47表達(dá)，觀察兩種細(xì)胞株在微流控芯片轉(zhuǎn)移模型內(nèi)處理前后細(xì)胞轉(zhuǎn)移數(shù)量的差異，證實(shí)CD47表達(dá)與細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲能力中發(fā)揮重要作用。進(jìn)一步在體內(nèi)成瘤以及轉(zhuǎn)移模型中亦證實(shí)下調(diào)CD47表達(dá)，A549細(xì)胞體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移能力均降低。說明CD47分子在判定非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象中起到重要的作用。
　　3.CD47在肺癌細(xì)胞株中表