CD47在非小細胞肺癌轉移中的作用及相關機制研究.pdf

1、背景和目的:肺癌在我國發(fā)病率極高，據(jù)報道近十幾年肺癌分別占在我國男性和女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一和第二位，并且發(fā)病年齡也出現(xiàn)了下降的趨勢。其中非小細胞肺癌作為肺癌的一個大類發(fā)病率也逐年增高，近年來肺癌相關領域基礎醫(yī)學研究及臨床診斷治療方法逐漸進步，越來越多的肺癌患者得到了規(guī)范的治療，使得肺癌的診治率有了很大的提升，然而由于肺癌表現(xiàn)出較強的侵襲性，尤其是一旦肺癌發(fā)生轉移，患者即將面臨極高的死亡威脅。因此，總體來說，對肺癌的轉移情況進行控制仍

2、然是肺癌領域需要解決的重要關鍵問題。然而目前腫瘤轉移相關分子機制仍不清楚。
　　為了探索腫瘤轉移的相關分子機制，近年來，CD47分子逐漸引起了大家的關注。其重要原因在于，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞可以表達“別吃我”信號，從而使得巨噬細胞對腫瘤吞噬作用減低，出現(xiàn)腫瘤對免疫逃逸現(xiàn)象，這種現(xiàn)象與腫瘤轉移密切相關。而腫瘤細胞高表達的CD47分子就是一種“別吃我”信號分子。當腫瘤細胞表面CD47分子與巨噬細胞的表面SIRPα分子組合成CD47-SIR

3、Pα信號復合體時，導致巨噬細胞SIRPα分子的細胞內部結構中免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)發(fā)生磷酸化，因此可以傳導抑制性信號通路，即“別吃我”信號來減少巨噬細胞對腫瘤細胞的吞噬活性，這樣便產生腫瘤細胞的免疫逃逸現(xiàn)象。而且CD47高水平表達與血液系統(tǒng)惡性腫瘤和部分實體腫瘤的分化程度、轉移能力、生存率及預后密切相關。CD47與腫瘤相關性研究得到越來越多關注，然而CD47在肺癌表達及與轉移的相關性等研究未見相關報道。另一方面，除了研究者關

4、注的CD47-SIRPα信號復合體引起的腫瘤免疫逃逸現(xiàn)象，另有研究者提出CD47與腫瘤生長和轉移的作用仍有其他機制參與其中，然而相關的機制研究甚少。因此，本研究亦將對CD47與轉移的相關作用機制進行初步的探討。我們通過組織標本和肺癌細胞株的CD47表達情況進行分別檢測，并利用體內和體外實驗分別對CD47與肺癌轉移的相關性進行分析驗證。最后對CD47與肺癌轉移的相關機制進行初步探討。本研究分以下三部分進行。
　　研究方法:1.非小細

5、胞肺癌組織CD47的表達及其臨床意義
　　選取20例非小細胞肺癌者切除的手術標本，利用western blotting方法對癌及癌旁組織中的CD47表達水平進行檢測。同時采用免疫組織化學檢測方法對80例非小細胞肺癌患者的石蠟組織切片對CD47表達水平進行檢測，通過免疫組織化學評分將80例患者按照CD47表達水平分為低表達CD47組和高表達CD47組，利用統(tǒng)計學分析的方法對不同CD47表達水平與病理分型、腫瘤分化程度及TNM分期等臨

6、床病理特征進行分析。
　　2.CD47在NSCLC侵襲轉移中的作用
　　本部分研究分別從體外實驗和體內實驗兩方面進行闡述。體外實驗部分:首先利用western blot、real-time PCR和細胞免疫熒光對不同肺癌細胞株的CD47表達情況進行檢測。為驗證CD47表達水平與細胞轉移能力的關系，我們構建了基于微流控芯片技術的轉移模型。利用該模型我們可以對細胞在不同情況下的轉移情況進行實時的動態(tài)觀察。利用RNA干擾技術和質粒

7、轉染技術分別下調或上調肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的CD47表達，將進行不同處理的各組細胞株分別注入微流控芯片轉移模型內觀察72小時后細胞的轉移情況，分析不同CD47表達水平表現(xiàn)出的肺癌細胞體外轉移能力的差異和區(qū)別。體內實驗部分:通過皮下注射構建原位肺癌模型、通過尾靜脈注射構建肺癌移植模型，同時利用shRNA穩(wěn)定下調A549細胞的CD47表達，觀察在兩種動物模型中不同CD47表達的A549細胞的原位成瘤以及腫瘤轉移

8、情況，進一步驗證CD47與肺癌發(fā)展轉移的影響。
　　3.CD47促進非小細胞肺癌轉移機制的初步探討
　　為探討Cdc42作為CD47的下游分子參與非小細胞肺癌侵襲和轉移我們進行以下研究，利用western blot方法檢測不同肺癌細胞株CD47和Cdc42的表達情況;通過RNA干擾技術和質粒轉染技術分別下調或上調肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520的CD47表達，進一步觀察CD47表達水平變化是否伴隨Cdc42

9、表達改變。上調CD47表達的A549和NCI-H520細胞株再利用RNA干擾技術下調Cdc42表達后觀察不同處理情況的細胞株在微流控芯片轉移平臺內細胞轉移能力的情況。最后對80例非小細胞肺癌患者的石蠟切片CD47表達與Cdc42表達情況進行統(tǒng)計分析。
　　結果:1.非小細胞肺癌組織CD47的表達及其臨床意義
　　利用western blotting蛋白檢測方法對20例非小細胞肺癌患者的手術切除組織標本的癌及癌旁組織中CD47

10、表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)癌組織的CD47表達水平明顯高于癌旁組織(P＜0.05)。同時采用免疫組織化學檢測方法對80例非小細胞肺癌患者的石蠟切片對CD47表達水平進行檢測，結果亦證實癌組織CD47表達明顯高于癌旁組織，對不同患者的CD47表達水平進行分組，結果發(fā)現(xiàn)高表達CD47與TNM分期密切相關，高表達CD47的患者更易出現(xiàn)淋巴轉移和遠處轉移;另外高表達CD47與臨床分期亦相關，高表達CD47的患者臨床分期越差。提過提示CD47表達水平

11、與非小細胞肺癌的轉移和侵襲相關，對CD47的表達檢測將對臨床轉移和預后的判斷具有重要意義。
　　2.CD47在NSCLC侵襲轉移中的作用
　　為了在體外觀察驗證細胞的轉移能力，我們成功構建了基于微流控芯片技術的細胞轉移模型。利用該模型我們可以實時對不同細胞的轉移情況進行動態(tài)觀察。為了更加全面驗證的CD47在NSCLC侵襲轉移中的作用，我們分別選取了肺腺癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520分別進行檢測分析。利用RNA

12、干擾技術成功將A549和NCI-H520的CD47表達水平下調，進而將未處理和下調CD47表達的A549和NCI-H520細胞分別注入微流控芯片轉移模型內，觀察72小時后細胞的轉移情況，結果證實在下調CD47表達的A549和NCI-H520細胞轉移數(shù)量較對照組明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。為進一步驗證，我們利用質粒轉染A549和NCI-H520細胞穩(wěn)定上調CD47表達，結果發(fā)現(xiàn)在上調CD47表達后A549和NCI-H52

13、0的細胞轉移數(shù)量明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。體內實驗進一步觀察，穩(wěn)定下調CD47表達的A549組6只裸鼠的皮下成瘤體積大小較A549組明顯減小;在尾靜脈注射轉移模型小鼠中同樣觀察到穩(wěn)定下調CD47表達的A549組形成的肝轉移結節(jié)數(shù)量少于A549組。
　　3.CD47促進非小細胞肺癌轉移機制的初步探討
　　通過western blot檢測了不同肺癌細胞株CD47蛋白表達與Cdc42蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)在高表達C

14、D47的細胞株中Cdc42也呈高表達，反之亦然。為驗證Cdc42作為CD47的下游分子參與了肺癌細胞的侵襲和轉移，我們對A549和NCI-H520分別下調或上調CD47表達，利用western blot檢測了Cdc42的蛋白表達情況，結果表明CD47表達水平的變化伴隨了Cdc42表達水平的改變。對80例肺癌患者對組織切片進行免疫組織化學染色觀察，發(fā)現(xiàn)在高表達CD47的患者中80.4％也存在Cdc42高表達;在低表達CD47的患者中85.

15、3％也存在Cdc42低表達。表明CD47表達調節(jié)了Cdc42的表達情況。為進一步驗證CD47通過Cdc42調節(jié)細胞的轉移和侵襲，我們利用質粒轉染A549和NCI-H520上調CD47的表達，再利用RNA干擾技術下調Cdc42表達，在微流控芯片轉移平臺內觀察下調Cdc42表達后細胞的侵襲轉移數(shù)量較未下調Cdc42表達的對照組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:1.通過western blot和免疫組織化學染色檢測

16、到非小細胞肺癌組織標本的CD47表達癌組織明顯高于癌旁組織;CD47表達與患者轉移情況、臨床分期相關，高表達CD47的患者臨床分期越差、更易出現(xiàn)淋巴轉移和遠處轉移。因此提示CD47分子可以在非小細胞肺癌中判斷侵襲和轉移的一個指標。
　　2.成功構建了可以模擬細胞侵襲轉移過程的微流控芯片轉移模型。在該芯片模型內可以實現(xiàn)細胞的三維培養(yǎng)并對細胞的侵襲轉移數(shù)量進行實時的動態(tài)觀察，通過比較轉移細胞數(shù)量的差別來直觀驗證細胞的轉移能力。采用肺腺

17、癌細胞株A549和肺鱗癌細胞株NCI-H520作為研究對象，利用RNA干擾技術和質粒表達下調和上調兩種細胞株的CD47表達，觀察兩種細胞株在微流控芯片轉移模型內處理前后細胞轉移數(shù)量的差異，證實CD47表達與細胞的轉移侵襲能力中發(fā)揮重要作用。進一步在體內成瘤以及轉移模型中亦證實下調CD47表達，A549細胞體內成瘤和轉移能力均降低。說明CD47分子在判定非小細胞肺癌的侵襲和轉移現(xiàn)象中起到重要的作用。
　　3.CD47在肺癌細胞株中表