外泌體在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、肺癌是導(dǎo)致全球死亡病例最多的惡性腫瘤之一，5年生存率僅約15.6％。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80％-85％，主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌等。病理類型、腫瘤分期等臨床特征是惡性腫瘤重要的預(yù)后因素。近期發(fā)現(xiàn)，液相活檢比如循環(huán)外泌體(crExo)，也能為惡性腫瘤提供重要的預(yù)后信息。外泌體是起源于內(nèi)體的、直徑30nm-150nm的細(xì)胞外囊泡。外泌體中有多種類型的分子，包括蛋白質(zhì)、miRNA、mRNA、DNA等。且外泌體參與細(xì)胞之間

2、的物質(zhì)交換和信息傳遞，從而發(fā)揮生物學(xué)功能。許多惡性腫瘤的crExo內(nèi)含物不同于非腫瘤人群，并且可能和腫瘤的進(jìn)展情況密切相關(guān)。有證據(jù)表明，crExo中的內(nèi)含物比如RNA、蛋白質(zhì)等，可作為某些惡性腫瘤的生物標(biāo)志物。為了探討外泌體在NSCLC患者中的預(yù)后作用及其機(jī)制，本文進(jìn)行了如下研究:
　　第一章 血漿中外泌體濃度在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的作用
　　目的：
　　研究血漿中crExo濃度與NSCLC患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系。

3、r>　　方法：
　　將血漿crExo用商業(yè)化試劑分離后，用透射電子顯微鏡(TEM)、western blot及NanoSight進(jìn)行鑒定。使用乙酰膽堿酯酶(AChE)法、二喹啉甲酸(BCA)法和納米顆粒追蹤分析技術(shù)(NTA)定量20個(gè)NSCLC患者crExo濃度，并分析這三種方法結(jié)果之間的關(guān)聯(lián)性。選擇與NTA法關(guān)聯(lián)性更強(qiáng)的定量方法測定NSCLC患者的crExo濃度。并分析crExo濃度與NSCLC患者的臨床特征及總生存期(OS)之

4、間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、分離的crExo樣品電鏡下為圓形，直徑在30nm-100nm之間。western blot結(jié)果表明，crExo樣品表達(dá)外泌體標(biāo)志物蛋白CD63和CD9，輕微表達(dá)albumin，而不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白標(biāo)志物calnexin。NanoSight結(jié)果表明，樣品粒徑在50nm-150nm之間，粒徑眾數(shù)為73nm。這些結(jié)果說明，用本法分離crExo是可行的。
　　2、三種外泌體定量方法（BCA法、AC

5、hE法和NTA法）的結(jié)果之間彼此相關(guān)。AChE法與NTA法的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度(r=0.79，P＜0.001)要大于BCA法與NTA法的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度(r=0.64，P=0.003)。
　　3、采用AChE法測定208例NSCLC患者crExo濃度，發(fā)現(xiàn)晚期（Ⅲb-Ⅳ期）患者的crExo濃度高于早期(Ⅰ-Ⅲa)患者(P＜0.001)，合并COPD的患者crExo濃度高于未患COPD的患者(P=0.023)。crExo濃度在不同性別、不同吸煙狀況或

6、不同病理類型的NSCLC患者之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。crExo濃度與NSCLC患者的年齡也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。
　　4、Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型結(jié)果提示，校正吸煙狀態(tài)、腫瘤分期、手術(shù)及化療因素后，高濃度crExo是NSCLC患者獨(dú)立不良預(yù)后因子(P=0.033;HR=1.72，95％ CI:1.05-2.83)。時(shí)間依賴性受試者工作特征曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)結(jié)果表明，加入crExo濃度這一因素使得

7、Cox模型預(yù)測結(jié)局的效能總體趨于好轉(zhuǎn)。但是，在隨訪6個(gè)月、12個(gè)月、18個(gè)月及24個(gè)月時(shí)，兩個(gè)模型預(yù)測結(jié)局能力的差異都沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義
　　結(jié)論：
　　crExo濃度與NSCLC患者的腫瘤分期及是否合并COPD有關(guān)，并可作為NSCLC患者獨(dú)立預(yù)后因子。
　　第二章 血漿中外泌體miRNA在非小細(xì)胞肺癌預(yù)后中的作用
　　目的：
　　探討肺腺癌與健康對(duì)照crExo中miRNA表達(dá)譜的差異，并研究crExo miR

8、NA在NSCLC患者預(yù)后中的意義。
　　方法：
　　用miRNA芯片檢測10例肺腺癌和10例匹配（年齡、性別、吸煙狀況）健康對(duì)照的crExo miRNA表達(dá)譜。用18個(gè)crExo樣品評(píng)估四個(gè)候選內(nèi)參基因(SNORD49A、let-7a-5p、miR-30a-5p和miR-30e-5p)的穩(wěn)定性。根據(jù)芯片結(jié)果并結(jié)合既往文獻(xiàn)，選擇若干crExo miRNA以研究它們在NSCLC患者預(yù)后中的作用。
　　結(jié)果：
　　1、

9、芯片檢測的84個(gè)miRNA中，有25個(gè)miRNA和5個(gè)miRNA在肺腺癌患者crExo中分別為低表達(dá)和高表達(dá)。
　　2、內(nèi)參評(píng)估結(jié)果表明，在四個(gè)候選crExo內(nèi)參基因中，let-7a-5p最穩(wěn)定。
　　3、根據(jù)miRNA芯片差異表達(dá)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，選擇9個(gè)crExo miRNA(miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-19a-3p、miR-194-5p、let-7g-5p、miR-141-3p、miR-21-5p

10、、miR-375和miR-1290)，以評(píng)估它們在NSCLC患者預(yù)后中的意義。其中，crExomiR-21-5p、miR-375和miR-1290是通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)而選擇的。結(jié)果表明， miR-21-5p、miR-375和miR-1290均在NSCLC患者crExo中高表達(dá)。
　　4、以let-7a-5p為內(nèi)參，使用qPCR檢測196例NSCLC患者crExo中以上9個(gè)miRNA的表達(dá)。Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型表明，crExo中miR-23

11、b-3p(P=0.001;HR=2.42，95％ CI:1.45-4.04)、 miR-10b-5p(P=0.013; HR=2.22,95％ CI:1.18-4.16)和miR-21-5p(P=0.003; HR=2.12，95％ CI:1.28-3.49)為NSCLC患者獨(dú)立預(yù)后因子。時(shí)間依賴性AUC結(jié)果表明，加入這三個(gè)crExo miRNA后，Cox模型預(yù)測結(jié)局的效能整體好轉(zhuǎn)。在隨訪12個(gè)月時(shí)，AUC從0.88增大到0.91(P=

12、0.015)。
　　結(jié)論：
　　肺腺癌患者與健康對(duì)照相比，crExo的miRNA表達(dá)譜有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。let-7a-5p可作為crExo miRNA定量研究中的內(nèi)參基因。crExo中的miR-23b-3p、miR-10b-5p及miR-21-5p表達(dá)水平可作為NSCLC患者獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志;與單純用臨床指標(biāo)的預(yù)后模型相比，加入這三個(gè)crExo miRNA可以增加模型預(yù)后預(yù)測的效能。
　　第三章 肺癌細(xì)胞外泌體在上皮-間質(zhì)

13、轉(zhuǎn)變中的作用研究
　　目的：
　　上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程密切相關(guān)。本部分主要目的是研究肺癌細(xì)胞外泌體在EMT中的作用。
　　方法：
　　TGF-β1刺激A549肺腺癌細(xì)胞后，通過形態(tài)學(xué)觀察及EMT標(biāo)志物(E-cadherin、N-cadherin及Vimentin)的檢測，評(píng)估A549細(xì)胞是否發(fā)生EMT。采用超速離心法分離A

14、549細(xì)胞條件培養(yǎng)基中的外泌體(conditioned medium-derived exosome，CM-Exo)，并用TEM、NanoSight和western blot對(duì)CM-Exo進(jìn)行鑒定。確定CM-Exo miRNA最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因后，檢測A549細(xì)胞及其CM-Exo在EMT過程中8個(gè)miRNA(miR-23b-3p、miR-10b-5p、miR-194-5p、let-7g-5p、miR-19a-3p、miR-21-5p、

15、miR-1290和miR-375)的表達(dá)。用PKH67熒光染料標(biāo)記CM-Exo后，觀察肺癌細(xì)胞能否攝取CM-Exo。并研究CM-Exo能否促進(jìn)A549肺癌細(xì)胞發(fā)生EMT。
　　結(jié)果：
　　1、TGF-β1誘導(dǎo)后，A549細(xì)胞發(fā)生了符合EMT特征的形態(tài)變化及分子特征變化。本研究中，與Vimentin及N-cadherin相比，上皮性標(biāo)志物E-cadherin是更加敏感的EMT標(biāo)志物。
　　2、TEM、NanoSight和

16、western blot結(jié)果均表明，超速離心法分離的CM-Exo樣品符合外泌體的特征。
　　3、用qPCR檢測了12個(gè)CM-Exo樣本中四個(gè)候選內(nèi)參let-7a-5p、5s rRNA、miR-16-5p和U6的表達(dá)。用在線工具RefFinder分析qPCR數(shù)據(jù)，結(jié)果表明U6是CM-Exo最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　4、發(fā)生EMT的A549細(xì)胞中，8個(gè)miRNA表達(dá)均下調(diào)（FC[fold change，倍數(shù)變化]＜1.00，P＜0

17、.05）;其分泌的CM-Exo中則顯著富集了miR-21-5p(FC=6.03，P＜0.001)和miR-23b-3p(FC=2.96，P＜0.001)，但miR-10b-5p的表達(dá)無顯著變化(FC=0.91，P=0.144)。此外，在發(fā)生EMT的細(xì)胞分泌的CM-Exo中，miR-1290(FC=0.27，P＜0.001)、miR-194-5p(FC=0.81,P=0.017)和miR-19a-3p(FC=0.57,P=0.006)表達(dá)