結(jié)直腸癌中microRNA-615基因甲基化及其生物學(xué)特性探究.pdf

1、背景：
　　MicroRNAs(miRNAs)被認(rèn)為在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，越來越多研究表明，大約一半左右調(diào)控人類miRNAs的基因與CpG島存在一定關(guān)聯(lián)。而表觀遺傳學(xué)上的改變?nèi)鏒NA甲基化可以對此類miRNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。本研究著眼于對基因MIR615的甲基化調(diào)控作用和microRNA-615在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)功能進(jìn)行探討。
　　在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在46例結(jié)直腸癌組織

2、中基因MIR615的甲基化陽性率高于其配對癌旁正常組織(39.1％vs15.2％，p=0.003);在27例結(jié)直腸癌組織中miR-615-3p表達(dá)低于其配對癌旁正常組織(p=0.047)。同時，基因MIR615甲基化陽性的結(jié)直腸癌組織中miR-615-3p表達(dá)低于甲基化陰性的結(jié)直腸癌組織(p=0.027)?；騇IR615甲基化陽性患者的3年無病生存率(DFS)低于基因MIR615甲基化陰性患者(60.2％vs80.3％，p=0.005

3、)。應(yīng)用Cox回歸進(jìn)行單因素及多因素分析顯示神經(jīng)侵犯和基因MIR615甲基化陽性為Ⅱ/Ⅲ期結(jié)直腸癌患者的兩個獨(dú)立預(yù)后因素。
　　材料與方法：
　　選取SW480，SW620及LoVo三株結(jié)直腸癌細(xì)胞株，利用去甲基化試劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-dC)對三株細(xì)胞株進(jìn)行去甲基化干預(yù)，并于干預(yù)前后通過定量甲基化特異性PCR(qMSP)檢測其甲基化水平變化，通過定量real-time(qRT-PCR)檢測其miR-615

4、-3p及miR-615-5p的表達(dá)水平變化。選取SW480及LoVo兩株結(jié)直腸癌細(xì)胞株，利用miR-615-3p和miR-615-5p的mimic及其對應(yīng)陰性對照試劑對其進(jìn)行轉(zhuǎn)染，通過CCK-8和Transwell方法檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞株增殖、遷移和侵襲的變化，探究miR-615-3p和miR-615-5p對結(jié)直腸癌細(xì)胞株的生物學(xué)影響。利用miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫對miR-615-3p可能的靶基因進(jìn)行預(yù)測，對預(yù)測結(jié)果進(jìn)行文獻(xiàn)查閱、KEGG

5、（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes）生物通路和GeneOntology基因功能富集分析，提示MEF2A可能是miR-615-3p調(diào)控的靶基因。檢測miR-615-3p的mimic轉(zhuǎn)染后SW480及LoVo細(xì)胞株MEF2AmRNA表達(dá)變化，檢測27對結(jié)直腸癌組織及其配對癌旁正常組織中的MEF2AmRNA表達(dá)水平，并與其miR-615-3p的表達(dá)水平進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析。
　　結(jié)果：

6、>　　根據(jù)USCS，NCBI數(shù)據(jù)庫及www.cpgisland.com分析，確定了miR-615存在甲基化調(diào)控的生物學(xué)基礎(chǔ)。SW620細(xì)胞株miR-615-3p及miR-615-5p表達(dá)量均最高，LoVo細(xì)胞株miR-615-3p及miR-615-5p表達(dá)量均最低(p=0.023，p=0.024);LoVo細(xì)胞株MIR615甲基化水平最高，SW620細(xì)胞株MIR615甲基化水平最低(p=0.013)。經(jīng)過去甲基化干預(yù)后，miR-615-

7、3p在SW480，SW620及LoVo三株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中相對表達(dá)量分別上調(diào)2.97倍，1.53倍和3.85倍(p＜0.001);miR-615-5p在SW480，SW620及LoVo三株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中相對表達(dá)量分別上調(diào)9.10倍，4.99倍和9.93倍(p＜0.001)。利用mimic上調(diào)miR-615-3p表達(dá)，SW480和LoVo細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染72小時后，miR-615-3pmimic組（以下稱3p實驗組）的相對細(xì)胞增殖水平低于轉(zhuǎn)

8、染陰性對照組（以下稱3p對照組）(p=0.017，p=0.001);轉(zhuǎn)染48小時后，SW480和LoVo細(xì)胞株3p實驗組遷移至Transwell小室下壁的細(xì)胞數(shù)目低于相應(yīng)3p對照組(p＜0.001，p＜0.001)，SW480和LoVo細(xì)胞株3p實驗組穿過基質(zhì)膠侵襲至Transwell小室下壁的細(xì)胞數(shù)目低于3p對照組(p=0.001，p=0.004)。利用mimic上調(diào)miR-615-5p表達(dá)，SW480和LoVo細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染72小時后

9、，miR-615-5pmimic組（以下稱5p實驗組）的相對細(xì)胞增殖水平低于轉(zhuǎn)染陰性對照組（以下稱5p對照組）(p=0.002，p=0.008);轉(zhuǎn)染48小時后，SW480和LoVo細(xì)胞株5p實驗組遷移至Transwell小室下壁的細(xì)胞數(shù)目低于相應(yīng)5p對照組(p＜0.001，p＜0.001)，SW480和LoVo細(xì)胞株5p實驗組穿過基質(zhì)膠侵襲至Transwell小室下壁的細(xì)胞數(shù)目低于5p對照組(p＜0.001，p=0.001)。轉(zhuǎn)染mi

10、R-615-3pmimic后，SW480及LoVo細(xì)胞株中MEF2AmRNA的表達(dá)水平分別下調(diào)至原來的0.57倍(p＜0.001)和0.76倍(p＜0.001);27對配對結(jié)直腸癌組織中MEF2A表達(dá)水平與miR-615-3p表達(dá)水平之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.541，p＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　細(xì)胞株體外實驗證實去甲基化干預(yù)可以上調(diào)miR-615-3p和miR-615-5p的表達(dá)，提示基因MIR615的CpG島高甲基化