維藥異常黑膽質(zhì)成熟劑對增生性瘢痕影響的實驗研究.pdf

1、瘢痕（Scar）是機(jī)體創(chuàng)傷愈合的必然產(chǎn)物。病理性瘢痕由于瘢痕增生過度，從而引起外形和（或）功能異常。增生性瘢痕（Hypertrophic Scar, HS）是臨床最常見的病理性瘢痕之一，造成患者外觀畸形和功能異常，給患者身體及心理帶來了較大的影響。由于其具體機(jī)制尚不十分清楚，且治療后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，當(dāng)前尚無較好的防治手段。增生性瘢痕的形成是多環(huán)節(jié)、多階段的一個復(fù)雜過程，包括凝血、早期炎癥、晚期炎癥、成纖維細(xì)胞的遷移與膠原的合成、血管化、上

2、皮化、重塑階段等。傳統(tǒng)治療方法包括局部加壓、激素注射、硅凝膠類以及放化療等雖然取得了一定效果，但在治療HS的同時，會出現(xiàn)副作用或不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到一定限制。
　　在傳統(tǒng)中醫(yī)理論中，HS認(rèn)為是由于氣血壅滯、經(jīng)絡(luò)痹阻、痰濕搏結(jié)或三者聯(lián)合所致，且基于活血化瘀、攻毒散結(jié)、通絡(luò)止痛、酸澀收斂和消結(jié)散瘢等方法在增生性瘢痕的防治上取得了一定進(jìn)展。雖然目前報道的中醫(yī)治療瘢痕的方法很多，但多數(shù)存在用藥途徑比較單一、劑型有限、多集中在單味藥物或是

3、提取物研究等缺陷，且療效不確切，容易復(fù)發(fā)等缺點(diǎn)。
　　維醫(yī)理論認(rèn)為體液是人類生命及生理活動過程的基本物質(zhì)體內(nèi)各種營養(yǎng)物質(zhì)在肝中產(chǎn)生的各種液體總稱為體液，分為膽液質(zhì)、血液質(zhì)、粘液質(zhì)和黑膽質(zhì)四種。它們貫穿于整個人生，在體內(nèi)自然形成，對健康和疾病起很大的作用。它們在體內(nèi)不斷地消耗，又不斷地產(chǎn)生，保持著一定的平衡狀態(tài)。四體液脫離自然的正常狀態(tài)，在數(shù)量和質(zhì)量上發(fā)生改變，成為對人體無益或有損的體液，稱為異常體液。在體內(nèi)外各種因素的作用下，人體

4、內(nèi)膽質(zhì)體液的量增加，功能改變，在機(jī)體基礎(chǔ)“熱”的作用下“燃燒”最終形成異常黒膽質(zhì)，是許多疾病維吾爾醫(yī)學(xué)病理生理上所共有的特性。治療上主要采用異常黒膽質(zhì)成熟劑（Abnormal Savda Munziq，ASMq）進(jìn)行調(diào)整。ASMq在防治部分腫瘤、糖尿病、高血壓等方面均取得了一定效果。體外研究顯示ASMq具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。研究表明皮膚增生性瘢痕是由于成纖維細(xì)胞過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原過度沉積所引起，又被稱為“皮膚

5、成纖維細(xì)胞良性腫瘤”。本研究在傳統(tǒng)維醫(yī)理論指導(dǎo)下提出科學(xué)假設(shè)：皮膚增生性瘢痕是異常黒膽質(zhì)體液在皮膚的局部沉積所致，是全身異常黒膽質(zhì)體液的局部表現(xiàn)。本研究擬通過兔耳增生性瘢痕動物模型以及體外人增生性瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)實驗，通過采用不同濃度 ASMq干預(yù)研究，來檢驗假設(shè)，并進(jìn)一步探討其細(xì)胞與分子機(jī)制。
　　研究表明，增生性瘢痕是由于成纖維細(xì)胞過度增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)膠原過度沉積所引起，其中TGF-β是導(dǎo)致增生性瘢痕形成的重要細(xì)胞因子，它

6、主要通過TGF-β/Smad信號通路參與調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖，凋亡，遷移和膠原代謝。TGF-β能同時觸發(fā)兩個可以對抗Smad蛋白介導(dǎo)的正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，其中就是快速激活Smad7啟動子，誘導(dǎo)Smad7基因表達(dá)，通過Smad7競爭性的占據(jù)TGF-βI型受體，抑制受體的蛋白激酶R-TGF-β的磷酸化而阻斷信號傳導(dǎo)，最后誘發(fā)它能促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)在傷口沉積，并能促進(jìn)纖維化，促使形成增生性瘢痕。
　　由于增生性瘢痕是成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外膠

7、原機(jī)制過度沉積而引起，因此抑制成纖維細(xì)胞增殖、抑制其膠原表達(dá)是防治增生性瘢痕的基礎(chǔ)。在細(xì)胞水平上，通過抑制細(xì)胞活性從而抑制成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡可以減少瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)量，可以在一定程度上防治增生性瘢痕；在細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中，改變細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等與膠原表達(dá)關(guān)系密切的亞細(xì)胞器活性可以在一定程度上具有減少瘢痕膠原的沉積的作用；在蛋白分子水平上，由于TGF-β/Smad信號通路是膠原產(chǎn)生的主要通路之一，且TGFβ1是促進(jìn)細(xì)胞

8、增殖的重要因子之一，因此通過減少TGFβ1的表達(dá)、增加Smad7的表達(dá)可以防治增生性瘢痕的發(fā)生和發(fā)展。
　　目的：
　　通過體內(nèi)體外實驗初步探討維藥ASMq對增生性瘢痕的影響及其作用機(jī)制，為臨床采用維醫(yī)維藥理論防治增生性瘢痕提供實驗和理論依據(jù)。
　　方法：
　　本研究采用兔耳瘢痕動物模型、體外增生性瘢痕成纖維細(xì)胞培養(yǎng)等途徑，分別從組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及分子生物學(xué)水平，探討維藥 ASMq對增生性瘢痕的影響及其作用機(jī)制。

9、第一部分，體內(nèi)實驗部分，灌胃給予維藥ASMq對兔耳增生性瘢痕影響的實驗研究。20只新西蘭大耳白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，即空白對照組（生理鹽水）三個實驗組分別為：（ASMq400 mg/kg)、（ASMq800 mg/kg）、（ASMq1200 mg/kg），每組5只。在創(chuàng)面形成后第45天（預(yù)實驗表明此時瘢痕增生達(dá)到峰值），分別取材后進(jìn)行各項指標(biāo)測定，備好切片后進(jìn)行四項實驗實施。
　?。?）通過計算瘢痕增生指數(shù)（Hypert

10、rophic Indes, HI），與空白對照組相比，從而明確各實驗組ASMq對兔耳增生性瘢痕有無影響。
　?。?）通過對各組創(chuàng)面范圍內(nèi)組織切片行HE染色，觀察各組兔耳瘢痕膠原排列以及成纖維細(xì)胞密度等情況，進(jìn)一步明確ASMq對兔耳增生性瘢痕膠原增生以及成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　?。?）通過對各組創(chuàng)面范圍內(nèi)組織行 Masson染色，觀察各組膠原排列以及膠原密度，通過采用單因素方差分析分析多組間膠原面密度，通過兩兩比較 q檢驗，

11、明確各組間膠原面密度有無差異。
　?。?）通過對兔耳創(chuàng)面范圍內(nèi)組織標(biāo)本通過透射電鏡觀察組織超微結(jié)構(gòu)（包括原膠原纖維、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)），通過與空白對照組相比較分析，初步在超微結(jié)構(gòu)層面進(jìn)一步觀察不同濃度維藥ASMq對兔耳增生性瘢痕的影響機(jī)制。第二部分，體外實驗，通過體外分離培養(yǎng)人增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞，分四組（1個空白對照組，3個實驗組）：空白對照組，低濃度ASMq組（0.1mg/ml），中濃度ASMq組（0.4mg/m

12、l），高濃度ASMq組（0.7mg/ml）。對各組在相應(yīng)時間點(diǎn)收集標(biāo)本進(jìn)行檢測：
　　（1）通過CCK-8方法，采用酶標(biāo)儀檢測 ASMq對成纖維細(xì)胞體外增殖有無影響。
　?。?）采用細(xì)胞凋亡分析試劑盒通過流式細(xì)胞分析儀行細(xì)胞凋亡檢測，擬明確不同濃度 ASMq對成纖維細(xì)胞凋亡的影響。
　?。?）采用細(xì)胞周期檢測試劑盒，通過流式細(xì)胞術(shù)分析ASMq對成纖維細(xì)胞細(xì)胞周期的影響，擬明確ASMq阻斷細(xì)胞增殖周期的具體時間點(diǎn)。

13、>　　（4）通過細(xì)胞劃痕遷移實驗觀察成纖維細(xì)胞遷移能力，擬明確不同濃度ASMq對成纖維細(xì)胞遷移能力有無影響。
　　（5）通過透射電鏡觀察成纖維細(xì)胞合成原膠原能力以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、細(xì)胞核、線粒體等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)情況，擬明進(jìn)一步分析明確不同濃度 ASMq對成纖維細(xì)胞表達(dá)膠原以及細(xì)胞凋亡、增殖的機(jī)制。第三部分，采用RT-PCR方法和免疫印跡等方法基于TGFβ/Smad通路分析ASMq對增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖、膠原表達(dá)影響的分子機(jī)

14、制。擬明確不同濃度 ASMq對增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖、膠原表達(dá)的分子機(jī)制。結(jié)果：第一部分，體內(nèi)兔耳增生性瘢痕動物模型實驗結(jié)果表明，灌胃給藥ASMq可以在一定程度上抑制增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，且在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度梯度依賴性。
　?。?）大體觀察結(jié)果，增生性瘢痕的厚度隨著ASMq的濃度逐漸增大，其厚度逐漸減小，硬度逐漸軟化，體積逐漸減小，趨于平復(fù)，顏色逐漸變淡。
　?。?）計算瘢痕增生指數(shù)結(jié)果，與空白組（3.87±

15、0.22）對比，實驗各組分別為（3.38±0.34）、（2.63±0.15）、（1.72±0.12）增生性指數(shù)（HI）隨著ASMq的濃度逐漸增加而降低（p<0.05）。
　　（3）通過HE染色在1200 mg/kg濃度維藥ASMq灌胃后對瘢痕增生的成纖維細(xì)胞密度觀察結(jié)果，與空白組（4022.5±189.3)相比，實驗組(3541.4±206.6)的顯示瘢痕增生不明顯，成纖維細(xì)胞數(shù)量及密度減少（p<0.05）。
　?。?）通過

16、Masson染色在1200 mg/kg濃度維藥ASMq灌胃后對瘢痕增生的膠原纖維情況觀察結(jié)果，與空白組（42.25±2.58）相比，實驗組(23.55±1.28)的增生性瘢痕膠原纖維面密度明顯減少（p<0.05）。
　?。?）通過透射電鏡觀察不同濃度的ASMq對增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果；與空白組對比，隨著實驗組濃度的遞增成纖維細(xì)胞密度和膠原纖維面密度逐漸減少。第二部分，體外增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞干預(yù)實驗結(jié)果表明，在

17、一定濃度范圍內(nèi)ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞原膠原合成，抑制細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等）活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。生物學(xué)特性的影響。
　　（1）體外細(xì)胞培養(yǎng)原代和傳代及細(xì)胞凍存和復(fù)蘇情況結(jié)果，成纖維細(xì)胞界限清楚，胞體較大，呈棱形或不規(guī)則三角形，細(xì)胞質(zhì)向外伸出兩三個長短不同的突起，胞漿豐富、胞膜邊界清晰、核仁多以成雙出現(xiàn)大小均等。
　?。?）用

18、CCK-8法檢測各組 HSFs增殖活性結(jié)果，與空白對照組相比，不同濃度ASMq組以及陽性對照組5-Fu組的HSFs增值活性明顯降低，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　?。?）用流式細(xì)胞技術(shù)檢測各組 HSFs細(xì)胞凋亡結(jié)果，與空白對照組凋亡率為2.2％±0.59%，不同濃度ASMq實驗組凋亡率分別為14.1%±3.87%，23.5%±3.22%，38.8%±3.14%,43.7%±2.58%；ASMq組凋亡率明顯高于對照組，且

19、凋亡率隨ASMq濃度增加呈遞增趨勢。
　　（4）ASMq對HSFs細(xì)胞周期的影響結(jié)果，與空白對照組比較，不同濃度ASMq組HSFs在G2/M期細(xì)胞比例呈不同程度升高，具有濃度依賴性，即在0.1~1.0mg/ml濃度間，隨著ASMq濃度增加，G2/M期細(xì)胞比例從13.1%增加到29.5%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。
　?。?）ASMq干預(yù)增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞遷移實驗結(jié)果，與空白組相比，實驗組分別在0h、24h、

20、48h后，增生性瘢痕的成纖維細(xì)胞遷移能力隨著時間的延長而逐漸減弱（p<0.05）。
　?。?） ASMq對HSFs超微結(jié)構(gòu)的影響結(jié)果，從低倍和高倍鏡觀察到：0.4mg/ml組的成纖維細(xì)胞的細(xì)胞核消失；0.7mg/ml組成纖維細(xì)胞膜出現(xiàn)收縮；1mg/ml組成纖維細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體相對空白組。第三部分，通過體外對不同濃度ASMq干預(yù)后的增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞基于TGFβ/Smad通路分析，結(jié)果顯示ASMq可以抑制TGFβ1的表達(dá)，促進(jìn)

21、抑制型Smad7的表達(dá)。在分子生物水平方面，通過RT-PCR的檢測方法和western-blot檢測方法。
　?。?）ASMq對成纖維細(xì)胞TGF-β1mRNA表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對比，AMSq隨著藥物濃度的增加，TGF-β1mRNA表達(dá)量減少(P<0.05)。
　?。?）ASMq對成纖維細(xì)胞Smad7mRNA表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對比，ASMq隨著藥物濃度的增加Smad7mRNA表達(dá)量增加(P<0.05)。
　　

22、（3）ASMq對成纖維細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對比，ASMq隨著藥物濃度的增加，TGF-β1蛋白表達(dá)量減少(P<0.05)。
　?。?）ASMq對成纖維細(xì)胞Smad7蛋白表達(dá)的影響結(jié)果，與空白組對比，ASMq隨著藥物濃度的增加Smad7蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　灌胃給藥ASMq可以在一定程度上抑制兔耳增生性瘢痕的發(fā)生發(fā)展，且在一定濃度范圍內(nèi)具有濃度梯度依賴性，其通過抑制膠原合

23、成和成纖維細(xì)胞增殖途徑發(fā)揮作用。在一定濃度范圍內(nèi)，ASMq具有抑制人增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用；細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示ASMq具有抑制成纖維細(xì)胞原膠原合成，抑制細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、線粒體等）活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等作用。ASMq可以抑制人增生性瘢痕來源成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)，促進(jìn)抑制型Smad7的表達(dá)。綜上表明ASMq可以基于TGFβ/Smad通路抑制成纖維細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及抑制膠原表達(dá)，從而