異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮抗腫瘤及逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的一類疾病。尋找有效的抗腫瘤藥物與方法，徹底攻克腫瘤是世界醫(yī)學(xué)界的重要研究課題。腫瘤治療強(qiáng)調(diào)綜合治療，因中醫(yī)中藥的應(yīng)用可使患者癥狀改善顯著，全身狀態(tài)保持較好，病情發(fā)展較慢，腫瘤亦可縮小或帶瘤長期生存，故其在中晚期腫瘤的綜合治療中占有重要地位。腫瘤化療過程中，出現(xiàn)多藥耐藥(Multidrug resistance MDR)是化療失敗的主要原因之一。當(dāng)今抗腫瘤藥物發(fā)展戰(zhàn)略的重點(diǎn)之一是從天然藥物中尋找活性成分，而我國有豐

2、富的中藥材資源以及數(shù)千年的中醫(yī)藥理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)中藥抗腫瘤作用的研究與開發(fā)前景良好。目前已篩選出一些具有抗腫瘤作用的天然中藥及單體，如苦參堿、三羥異黃酮、白藜蘆醇、紫杉醇等，其中一些已廣泛地應(yīng)用于臨床，顯示出良好的效果。同樣，天然藥物中尋找逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性、增加化療藥物作用、有效低毒的逆轉(zhuǎn)劑，長期以來一直是醫(yī)學(xué)界關(guān)注的的熱點(diǎn)。 維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為，異常黑膽質(zhì)作為膽液質(zhì)、血液質(zhì)、粘液質(zhì)、黑膽質(zhì)被“燃燒”，繼而“沉淀”的最終病理產(chǎn)物或表

3、現(xiàn)形式，經(jīng)常導(dǎo)致腫瘤等難治性疾病。臨床大部分腫瘤患者也表現(xiàn)為異常黑膽質(zhì)性。我區(qū)名老維醫(yī)巴黑.玉素甫和吐爾遜·托乎提阿吉等多年來根據(jù)維醫(yī)理論和臨床治療原則將維醫(yī)異常黑膽質(zhì)成熟劑應(yīng)用于癌癥患者的治療，取得良好的療效，被患者譽(yù)為“神醫(yī)”。 腫瘤的維醫(yī)異常黑膽質(zhì)成熟劑治療有良好效果，其促使我們，采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)異常黑膽質(zhì)成熟劑的抗腫瘤作用進(jìn)行深入研究，揭示其作用機(jī)理。十幾年來，哈木拉提教授為首的課題組采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)對(duì)異常黑膽質(zhì)成熟劑

4、作用機(jī)理進(jìn)行了較深入的研究。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，該復(fù)方能夠促進(jìn)免疫細(xì)胞的生長和增殖，提高機(jī)體的免疫功能，增強(qiáng)免疫器官中抗氧化酶的活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗癌能力[3-8]。 研究發(fā)現(xiàn)，異常黑膽質(zhì)成熟劑具有明顯的抗氧化應(yīng)激對(duì)淋巴細(xì)胞DNA的損傷作用及減輕氧化造成的淋巴細(xì)胞毒性，能上調(diào)淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，能顯著抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的凋亡，能明顯降低氧化誘導(dǎo)對(duì)淋巴細(xì)胞NF-kB的激活作用，同時(shí)異常黑膽質(zhì)成熟劑本身也能激活淋巴

5、細(xì)胞的NF-kB作用。異常黑膽質(zhì)成熟劑中可能存在作用于細(xì)胞增殖凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路和影響相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)的活性成份，這些僅在已發(fā)生癌變的細(xì)胞中發(fā)揮著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、上調(diào)抑癌基因表達(dá)和下調(diào)凋亡抑制基因的作用，而且在正常細(xì)胞中發(fā)揮著抗氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞DNA的損傷作用及減輕氧化造成的細(xì)胞毒性，通過上調(diào)淋巴細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞的凋亡、降低氧化誘導(dǎo)對(duì)淋巴細(xì)胞NF-κB的激活作用，從而預(yù)防細(xì)胞發(fā)生癌變。通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察受

6、照射小鼠體重、脾臟指數(shù)、骨髓功能和SOD等指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)輻射后各組小鼠體質(zhì)量均下降；異常黑膽質(zhì)成熟劑干預(yù)各組脾臟指數(shù)明顯低于對(duì)照，各組異常黑膽質(zhì)成熟劑干預(yù)后受照射小鼠的SOD值、白細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞數(shù)和30d生存率均有明顯的升高。認(rèn)為在活體組織中異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)輻射有確切的保護(hù)作用。同時(shí)，以往工作中，發(fā)現(xiàn)異常黑膽質(zhì)成熟劑對(duì)HepG2(人肝癌細(xì)胞)[15]、Hela(人宮頸癌細(xì)胞)、T淋巴瘤細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞體外具有抗癌作用，已初步確定異常

7、黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮是異常黑膽質(zhì)成熟劑重要的抗癌活性成分。 我們應(yīng)用運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，研究異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、凋亡、分化的影響；運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來研究總黃酮對(duì)結(jié)腸癌癌前期病變的預(yù)防和抑制作用；以進(jìn)一步明確抗癌譜的同時(shí)探討異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性的作用機(jī)制，主要內(nèi)容如下： 1.異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株(Caco-2)生長、凋亡及DNA鏈斷裂的影響本研究中以人結(jié)腸癌細(xì)胞株(Ca

8、co-2)等作為研究抗癌活性的體外細(xì)胞模型，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)研究異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)癌細(xì)胞體外生長和凋亡調(diào)控的影響，從而探討異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理。探索維吾爾醫(yī)異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮的抗腫瘤作用機(jī)理。 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮不同作用時(shí)間對(duì)Caco-2細(xì)胞抑制作用的IC50分別為5.99mg/ml(48h)及3.02mg/ml(72h)。異常黑膽質(zhì)成

9、熟劑總黃酮與Caco-2細(xì)胞共同培育48h后，對(duì)Caco-2細(xì)胞DNA鏈斷裂的作用有所不同。當(dāng)樣品濃度在0.5～5.0mg/ml時(shí)，總黃酮對(duì)DNA沒有產(chǎn)生明顯的影響，即凝膠圖譜上沒有出現(xiàn)明顯的“梯子”樣DNA條帶。但在7.5mg/ml濃度時(shí)，對(duì)Caco-2細(xì)胞DNA鏈產(chǎn)生明顯的作用，出現(xiàn)了較明顯的“梯子”樣DNA條帶。流式細(xì)胞術(shù)觀察表明，當(dāng)Caco-2細(xì)胞與異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮共同培養(yǎng)48小時(shí)后，與空白對(duì)照組比較，表現(xiàn)出濃度依賴性得阻

10、滯細(xì)胞周期，使細(xì)胞滯留于sub-G1期，癌細(xì)胞凋亡率逐漸提高(P<0.05)，尤其是當(dāng)濃度為7.5mg/ml時(shí)，明顯提高Caco-2細(xì)胞在sub-G1期的百分比。 2.異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)1，2-二甲肼(DMH)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸異常隱窩灶的影響1，2-二甲肼(1，2-dimethylhydrazine，DMH)誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸癌前期病變是一個(gè)長期、多因素共同參與的過程，其引起的細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、組織病理學(xué)變化和腫瘤形成的分子機(jī)制的改變

11、等方面均與人類的結(jié)腸癌前期的形成過程比較近似，是研究結(jié)腸癌形成的一個(gè)良好模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮預(yù)防組和抑制組可以明顯抑制DMH誘發(fā)的大鼠體重減輕的趨勢(shì)，明顯抑制DMH誘發(fā)的大鼠ACF、AC總數(shù)及其多樣性，明顯抑制由DMH攻擊引起的大鼠免疫器官重量減輕，提高DMH誘發(fā)大鼠免疫器官(胸腺及脾臟)指數(shù)。本研究發(fā)現(xiàn)異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮抑制DMH誘發(fā)的大鼠結(jié)腸癌癌前期病變的作用，這與其抑制ACF形成有關(guān)，而且證實(shí)了

12、異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮具有較強(qiáng)的體內(nèi)預(yù)防及抑制腫瘤形成作用。 3.異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)人肝癌耐藥細(xì)胞株Bel/Fu逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機(jī)制的研究我們應(yīng)用MTT實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定Bel/Fu的IC50、耐藥細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)觀察異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)耐藥細(xì)胞株Bel/Fu(肝癌耐藥細(xì)胞)逆轉(zhuǎn)作用，同時(shí)觀察異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮和氟尿嘧啶協(xié)同效果。FCM(流式細(xì)胞技術(shù))觀察細(xì)胞周期改變和凋亡。免疫組織化學(xué)法(S-P)法檢測(cè)細(xì)胞P糖蛋白的表達(dá)。

13、逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDR1、GSTπ、TopoⅡ、凋亡基因mRNA的表達(dá)。研究異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)人肝癌細(xì)胞株Bel/Fu逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用機(jī)制。 異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞Bel/Fu的IC50是2000.681μg/ml，用藥安全范圍很大。異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮在390μg/ml濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞無明顯的殺傷作用，但與抗癌藥物5-Fu合用時(shí)，合并用藥組的細(xì)胞毒性作用與單獨(dú)用5-Fu抗癌藥物的相比有顯著性差異(P<

14、0.01)，表明異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮與抗癌藥物有協(xié)同作用，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為7.8。隨異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮濃度的加大集落逐漸變小、集落形成率減少，390μg/ml時(shí)表現(xiàn)為極小的集落，集落形成率僅為3.5％、細(xì)胞形狀不規(guī)則有中毒顆粒，460μg/ml基本無集落形成。免疫組織化學(xué)法(S-P)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮抑制P-gp的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)MDR1/mRNA和P-gp的表達(dá)有明顯的抑制作用。對(duì)MRP

15、、GSTπ和TopoⅡ基因表達(dá)進(jìn)行了同步觀察，發(fā)現(xiàn)異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮同樣可以升高的TopoⅡαmRNA水平，提示異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮也是TopoⅡα耐藥逆轉(zhuǎn)劑。流式細(xì)胞技術(shù)觀察結(jié)果，異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮以不同的濃度作用于Bel/Fu細(xì)胞48h后，對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生不同的影響。在2.5、5.0和7.5mg/ml時(shí)，凋亡細(xì)胞所特有的sub-G1期的百分比分別為0.9％、4.0％、7.8％，在2.5及7.5mg/ml時(shí)分別與空白對(duì)照組(0

16、.4％)比較具有顯著性差異(P<0.05)，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)Bel/Fu細(xì)胞凋亡(sub-G1)的誘導(dǎo)作用具有明顯的濃度依賴性。 4.結(jié)論4.1 由維吾爾醫(yī)復(fù)方衍生的異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮不僅具有體內(nèi)外抗腫瘤作用，而且具有體外逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥性之功效。 4.2 異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞(Caco-2)體外抗癌作用可能主要通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡等途徑來實(shí)現(xiàn)。即引起癌細(xì)胞DNA鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞

17、凋亡，癌細(xì)胞滯留于sub-G1期，使癌細(xì)胞凋亡率逐漸增高。 4.3 異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮抑制DMH誘發(fā)的大鼠結(jié)腸ACF形成，具有預(yù)防和抑制腫瘤發(fā)生作用。其部分機(jī)理在于提高使用DMH誘發(fā)的異常隱窩大鼠的胸腺指數(shù)達(dá)正常水平，抑制DMH誘發(fā)的異常隱窩大鼠體重的減輕，提高DMH誘發(fā)的異常隱窩大鼠免疫器官指數(shù)。 4.4 異常黑膽質(zhì)成熟劑總黃酮對(duì)肝癌耐藥細(xì)胞(Bel/Fu)具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥MDR的作用，其機(jī)制可能與抑制Bel/Fu