利用TMV病毒載體在煙草中瞬時表達Reteplase初步研究.pdf

1、急性心肌梗塞、腦梗塞等血栓栓塞性疾病的致殘率和致死率都很高，嚴重威脅著人類健康及生命。臨床上，以溶血栓為主的溶栓藥物療法是血栓疾病的首選治療方法。Reteplase(瑞替普酶)是臨床上治療血栓性疾病的常用藥物。Reteplase(瑞替普酶)商品化生產(chǎn)中存在成本高、價格昂貴等問題，探索和研究新型、簡易和高表達量的表達系統(tǒng)，是提高產(chǎn)量、降低成本的關(guān)鍵。與其它表達系統(tǒng)相比，植物病毒載體表達體系在短時間內(nèi)、在不影響環(huán)境的條件下，可以生產(chǎn)大量成本

2、低廉的、安全的目的蛋白。最新的蛋白質(zhì)體表達技術(shù)不僅可以提高目的蛋白的產(chǎn)量，還可以解決植物特有的糖基化修飾問題，甚至可以簡化下游純化技術(shù)?，F(xiàn)將兩種技術(shù)緊密的結(jié)合在一起，將為解決Reteplase(瑞替普酶)生產(chǎn)提供一條新的思路。
　　 本研究利用DNA重組技術(shù)，以煙草花葉病毒表達載體pJL TRBO-G為“骨架”(Backbone)，運用重疊延伸基因(gene splicing by overlap extension，SOE)擴

3、增技術(shù)將“修正”后的Reteplase序列克隆到載體的Pac1和Not I-HF之間。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的設(shè)計方案，將rPA信號肽、Prb1蛋白信號肽、EK序列、HFBI和Zrea-X3等序列插入不同的位置，構(gòu)建不同策略的煙草花葉病毒表達載體并在煙草植物本氏煙中瞬時表達且對表達情況進行初步分析。實驗結(jié)果如下：
　　 1.對人組織型纖溶酶原激活劑截斷突變體Reteplase的突變序列rPA-C9中存在的3個變異位點進行定點突變校

4、正。修正后的序列與FDA批準的溶栓藥物Reteplase的氨基酸序列完全一致。
　　 2.構(gòu)建了5種不同表達策略的Reteplase煙草花葉病毒瞬時表達載體。載體pJL TRBO-sprPA在寄主植物本氏煙中表達了有生物學(xué)活性的Reteplase，最大表達量約為200.6 ng/g鮮葉，最佳收取時間是第6d。初步證明利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)Reteplase是可行性的。
　　 3.利用TMV病毒載體表達系統(tǒng)在煙草中表達

5、的Reteplase有嚴重的降解現(xiàn)象。降解發(fā)生在Reteplase自身的2個蛋白酶識別位點處；降解過程發(fā)生在細胞內(nèi)部；降解原因可能是由于病毒侵染引起的寄主細胞蛋白酶水平和活性上升所致。推測TMV病毒載體表達系統(tǒng)不適用于產(chǎn)物對蛋白酶特別敏感的外源基因直接在寄主細胞質(zhì)中的表達。
　　 4.融合PB和病毒載體兩項技術(shù)的Reteplase表達載體，在煙草細胞中沒有形成PB顆粒，因而對其融合產(chǎn)物Reteplase沒有形成有效地保護。病毒侵