利用TMV病毒載體在煙草中瞬時(shí)表達(dá)Reteplase初步研究.pdf

1、急性心肌梗塞、腦梗塞等血栓栓塞性疾病的致殘率和致死率都很高，嚴(yán)重威脅著人類健康及生命。臨床上，以溶血栓為主的溶栓藥物療法是血栓疾病的首選治療方法。Reteplase(瑞替普酶)是臨床上治療血栓性疾病的常用藥物。Reteplase(瑞替普酶)商品化生產(chǎn)中存在成本高、價(jià)格昂貴等問題，探索和研究新型、簡(jiǎn)易和高表達(dá)量的表達(dá)系統(tǒng)，是提高產(chǎn)量、降低成本的關(guān)鍵。與其它表達(dá)系統(tǒng)相比，植物病毒載體表達(dá)體系在短時(shí)間內(nèi)、在不影響環(huán)境的條件下，可以生產(chǎn)大量成本

2、低廉的、安全的目的蛋白。最新的蛋白質(zhì)體表達(dá)技術(shù)不僅可以提高目的蛋白的產(chǎn)量，還可以解決植物特有的糖基化修飾問題，甚至可以簡(jiǎn)化下游純化技術(shù)?，F(xiàn)將兩種技術(shù)緊密的結(jié)合在一起，將為解決Reteplase(瑞替普酶)生產(chǎn)提供一條新的思路。
　　 本研究利用DNA重組技術(shù)，以煙草花葉病毒表達(dá)載體pJL TRBO-G為“骨架”(Backbone)，運(yùn)用重疊延伸基因(gene splicing by overlap extension，SOE)擴(kuò)

3、增技術(shù)將“修正”后的Reteplase序列克隆到載體的Pac1和Not I-HF之間。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)不同的設(shè)計(jì)方案，將rPA信號(hào)肽、Prb1蛋白信號(hào)肽、EK序列、HFBI和Zrea-X3等序列插入不同的位置，構(gòu)建不同策略的煙草花葉病毒表達(dá)載體并在煙草植物本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)且對(duì)表達(dá)情況進(jìn)行初步分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.對(duì)人組織型纖溶酶原激活劑截?cái)嗤蛔凅wReteplase的突變序列rPA-C9中存在的3個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變校

4、正。修正后的序列與FDA批準(zhǔn)的溶栓藥物Reteplase的氨基酸序列完全一致。
　　 2.構(gòu)建了5種不同表達(dá)策略的Reteplase煙草花葉病毒瞬時(shí)表達(dá)載體。載體pJL TRBO-sprPA在寄主植物本氏煙中表達(dá)了有生物學(xué)活性的Reteplase，最大表達(dá)量約為200.6 ng/g鮮葉，最佳收取時(shí)間是第6d。初步證明利用植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)Reteplase是可行性的。
　　 3.利用TMV病毒載體表達(dá)系統(tǒng)在煙草中表達(dá)

5、的Reteplase有嚴(yán)重的降解現(xiàn)象。降解發(fā)生在Reteplase自身的2個(gè)蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)處；降解過程發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)部；降解原因可能是由于病毒侵染引起的寄主細(xì)胞蛋白酶水平和活性上升所致。推測(cè)TMV病毒載體表達(dá)系統(tǒng)不適用于產(chǎn)物對(duì)蛋白酶特別敏感的外源基因直接在寄主細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)。
　　 4.融合PB和病毒載體兩項(xiàng)技術(shù)的Reteplase表達(dá)載體，在煙草細(xì)胞中沒有形成PB顆粒，因而對(duì)其融合產(chǎn)物Reteplase沒有形成有效地保護(hù)。病毒侵