攜帶Ubc9基因的病毒表達載體的構建及其在細胞中的表達.pdf

1、背景與目的：細胞內存在多種蛋白質共價修飾方式，如乙?；?、磷酸化、泛素化、甲基化等，它們對蛋白質發(fā)揮正常的生物學功能起著重要作用。近些年來幾種小的類泛素蛋白(ubiquitin-like proteins，Ubls)接連被發(fā)現(xiàn)，它們與泛素在二級結構上極其相似，且催化修飾過程的酶體系也具有很高的同源性，SUMO(smallubiquitin-related modifier)就是其中的重要成員之一。SUMO不像泛素化與底物結合來降解底物，而

2、是通過蛋白質間的相互作用完成SUMO化修飾(sumoylation)。SUMO化修飾調節(jié)多種生物學的過程，包括核質轉運，轉錄活性調解，DNA修復和復制，以及有絲分裂和減數(shù)分裂時染色體的行為。研究發(fā)現(xiàn)能被SUMO被其修飾的蛋白有百余種，例如RanGAP1，PML，IkBα，c-Jun和p53等。SUMO共價連接需要E1活化酶(Aos1/Uba2)，E2結合酶(Ubc9)，以及多種E3連接酶如PIAS家族、核孔蛋白RanBP2和Pc2。作為

3、唯一一種E2酶Uboc9對sumoylation的生物過程至關重要。本研究構建含Ubc9基因的病毒表達載體，轉染包裝細胞后使其產生病毒，收集病毒感染靶細胞，使細胞中的Ubc9基因過表達，以便于深入研究Ubc9基因對細胞的作用。
　　 方法：
　　 1.聚合酶鏈反應(PCR)擴增獲取目的基因Ubc9，定向插入逆轉錄病毒表達載體pMSCVneo，形成重組質粒pMSCV-Ubc9；脂質體法將pMSCV-Ubc9轉染逆轉錄病毒包

4、裝細胞PT67；G418篩選產毒細胞克隆，擴大培養(yǎng)產毒細胞克隆，收獲病毒感染BMSC細胞。用Western blot方法檢測Ubc9在BMSC細胞中的表達。
　　 2.把Ubc9基因定向插入腺病毒表達載體。pemⅠ酶切將穿梭質粒pAdTrack-CMV-Ubc9線性化；線性化的穿梭質粒pAdTrack-CMV-Ubc9與腺病毒骨架質粒pAdeasy-1在感受態(tài)BJ5183菌內進行同源重組，篩選陽性重組子pAdEasy-1/Ubc

5、9；再用PacⅠ酶切pAdEasy-1/Ubc9使之線性化，線性化的腺病毒質粒經脂質體轉染HEK293細胞，進行重組腺病毒的包裝和擴增。收集重組腺病毒，感染HeLa，用Western blot方法檢測Ubc9在HeLa細胞中的表達。
　　 結果：
　　 1.限制性酶切和測序鑒定證實Ubc9正確插入逆轉錄病毒表達載體。G418篩選獲得穩(wěn)定產毒的抗性細胞克隆，收獲病毒能有效感染BMSC細胞。
　　 2.通過PacⅠ酶