攜帶Ubc9基因的病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及其在細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、背景與目的：細(xì)胞內(nèi)存在多種蛋白質(zhì)共價(jià)修飾方式，如乙?；?、磷酸化、泛素化、甲基化等，它們對(duì)蛋白質(zhì)發(fā)揮正常的生物學(xué)功能起著重要作用。近些年來(lái)幾種小的類泛素蛋白(ubiquitin-like proteins，Ubls)接連被發(fā)現(xiàn)，它們與泛素在二級(jí)結(jié)構(gòu)上極其相似，且催化修飾過(guò)程的酶體系也具有很高的同源性，SUMO(smallubiquitin-related modifier)就是其中的重要成員之一。SUMO不像泛素化與底物結(jié)合來(lái)降解底物，而

2、是通過(guò)蛋白質(zhì)間的相互作用完成SUMO化修飾(sumoylation)。SUMO化修飾調(diào)節(jié)多種生物學(xué)的過(guò)程，包括核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，轉(zhuǎn)錄活性調(diào)解，DNA修復(fù)和復(fù)制，以及有絲分裂和減數(shù)分裂時(shí)染色體的行為。研究發(fā)現(xiàn)能被SUMO被其修飾的蛋白有百余種，例如RanGAP1，PML，IkBα，c-Jun和p53等。SUMO共價(jià)連接需要E1活化酶(Aos1/Uba2)，E2結(jié)合酶(Ubc9)，以及多種E3連接酶如PIAS家族、核孔蛋白R(shí)anBP2和Pc2。作為

3、唯一一種E2酶Uboc9對(duì)sumoylation的生物過(guò)程至關(guān)重要。本研究構(gòu)建含Ubc9基因的病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后使其產(chǎn)生病毒，收集病毒感染靶細(xì)胞，使細(xì)胞中的Ubc9基因過(guò)表達(dá)，以便于深入研究Ubc9基因?qū)?xì)胞的作用。
　　 方法：
　　 1.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增獲取目的基因Ubc9，定向插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體pMSCVneo，形成重組質(zhì)粒pMSCV-Ubc9；脂質(zhì)體法將pMSCV-Ubc9轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒包

4、裝細(xì)胞PT67；G418篩選產(chǎn)毒細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)產(chǎn)毒細(xì)胞克隆，收獲病毒感染BMSC細(xì)胞。用Western blot方法檢測(cè)Ubc9在BMSC細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2.把Ubc9基因定向插入腺病毒表達(dá)載體。pemⅠ酶切將穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Ubc9線性化；線性化的穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV-Ubc9與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdeasy-1在感受態(tài)BJ5183菌內(nèi)進(jìn)行同源重組，篩選陽(yáng)性重組子pAdEasy-1/Ubc

5、9；再用PacⅠ酶切pAdEasy-1/Ubc9使之線性化，線性化的腺病毒質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行重組腺病毒的包裝和擴(kuò)增。收集重組腺病毒，感染HeLa，用Western blot方法檢測(cè)Ubc9在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.限制性酶切和測(cè)序鑒定證實(shí)Ubc9正確插入逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。G418篩選獲得穩(wěn)定產(chǎn)毒的抗性細(xì)胞克隆，收獲病毒能有效感染BMSC細(xì)胞。
　　 2.通過(guò)PacⅠ酶