CEA乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá).pdf

1、鄭州大學(xué)碩士學(xué)位論文CEA乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá)姓名：袁云申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：人體解剖與組織胚胎學(xué)指導(dǎo)教師：張欽憲20060501鄭州人學(xué)2006屆碩士研究生論文CEA乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及其瞬時(shí)表達(dá)動(dòng)物的染色體，在動(dòng)物體內(nèi)得以表達(dá)并能遺傳給后代的～類動(dòng)物。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物用途眾多，其在建立疾病和藥物篩選的動(dòng)物模型方面就有重要作用。制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的～個(gè)基本要求就是有能夠表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物構(gòu)件，其基本組成部分包括調(diào)控區(qū)、目的

2、基因和polyA信號(hào)三部分。本研究中，使用已插入了乳清酸蛋自基因(m廿)24kb啟動(dòng)子及其下游插入O4kbpolyA信號(hào)的可指導(dǎo)外源基因在乳腺特異性表達(dá)的載體pwA，將克隆的目的基因21kbcEAcDNA連接于wAP啟動(dòng)予和polyA信號(hào)之間，構(gòu)建cEA乳腺特異性表達(dá)載體pwAcEA，該載體就包含了、W心啟動(dòng)子、CEA、poiyA三部分，即為轉(zhuǎn)基因構(gòu)件。構(gòu)建成功的p、I‰CEA表達(dá)載體通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑Upofectamine珊2000

3、轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞系及小鼠成纖維細(xì)胞系，以地高辛標(biāo)記的cEAcDNA為探針，采用原位雜交和免疫組化技術(shù)檢測(cè)CEA在兩種細(xì)胞系中的瞬時(shí)表達(dá)，驗(yàn)證了pWAc隊(duì)表達(dá)載體的乳腺特異性表達(dá)能力。材料與方法：1載體pwA—cEA的構(gòu)建：以含cEAcDNA目的基因的質(zhì)粒pGEM4cEA為模板，設(shè)計(jì)引物(上、下游引物分別帶有HindIII和xhoI酶切位點(diǎn)1，PCR擴(kuò)增cEA的cDNA片斷；以HindIII和xhoI對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，1％瓊脂糖凝膠電

4、泳回收2，1kb酶切片斷。以Hindm和xhoI雙酶切質(zhì)粒pⅥ，A，瓊脂糖凝膠電泳回收58kb酶切片斷。T4連接酶體外連接21kbcEAcDNA目的片斷和58kbpwA質(zhì)粒DNA片斷，16℃，連接過夜。重組體轉(zhuǎn)化感受念TGl細(xì)菌。將轉(zhuǎn)化菌涂于含AIIlp的LB培養(yǎng)皿上，37℃，培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑選6個(gè)克隆，接種于含_^IIlp的LB培養(yǎng)基中，37℃，振蕩培養(yǎng)過夜。小提質(zhì)粒，分別進(jìn)行HindllI單酶切、xhoI單酶切、HindIII和xh

5、oI雙酶切、HindIII和B鋤HI雙酶切鑒定。對(duì)插入片斷進(jìn)行序列測(cè)定。構(gòu)建成功的載體命名為pwAcEA。2載體pwA—cEA的瞬時(shí)表達(dá)鑒定：以隨機(jī)引物法地高辛標(biāo)記c隊(duì)cDNA探針，一20℃保存。將表達(dá)載體pwACEA與脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺試劑upofect啪ineTM2000混合轉(zhuǎn)染乳腺癌(MCF7)細(xì)胞和成纖維(Nm一3T3)細(xì)胞，培養(yǎng)36小時(shí)后，收集細(xì)胞，制備細(xì)胞滴片，一20℃保存。采用原位雜交及免疫組化技術(shù)，檢測(cè)cEA在細(xì)胞滴片的表達(dá)。Ⅱ