軍曹魚(yú)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ的克隆、表達(dá)及其原核表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本論文以軍曹魚(yú)為研究對(duì)象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)，成功克隆了軍曹魚(yú)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ(Insulin-like GrowthsFactors-Ⅰ，IGF-Ⅰ)基因序列，并對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能鑒定，同時(shí)研究了不同飼料糖水平對(duì)軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ基因組織特異性表達(dá)的影響，進(jìn)而通過(guò)質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建了軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ體外原核表達(dá)系統(tǒng)，并成功獲得重組蛋白，為深入研究IGF-Ⅰ基

2、因?qū)姴荇~(yú)的成長(zhǎng)和代謝調(diào)控，提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.軍曹魚(yú)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)生長(zhǎng)因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ) cDNA克隆和序列分析
　　根據(jù)已經(jīng)克隆出的鱸形目魚(yú)類(lèi)IGF-Ⅰ基因序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，采用PCR技術(shù)成功克隆了軍曹魚(yú)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ序列。其cDNA序列長(zhǎng)558bp，編碼185個(gè)氨基酸，其中信號(hào)肽含有44個(gè)氨基酸，成熟肽含有67個(gè)氨基酸，IGF-Ⅰ mRNA屬于Ea-4亞型。預(yù)測(cè)分子量為8.5

3、8 kDa，理論等電點(diǎn)為7.4。同源氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ成熟肽結(jié)構(gòu)和人類(lèi)一樣，都包括B、C、A、D區(qū)，其中B區(qū)和A區(qū)保守性較高，C區(qū)和D區(qū)保守性較差。軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ基因與人類(lèi)的同源性高達(dá)74％，與黃鰭棘鯛的同源性高達(dá)99％。采用泊松校正法構(gòu)建的IGF-Ⅰ系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明，軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ跟海洋魚(yú)類(lèi)親緣性較近，跟淡水魚(yú)類(lèi)和無(wú)脊椎動(dòng)物親緣性較遠(yuǎn)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real Time PCR，RT-PCR)方法，檢測(cè)

4、分析IGF-Ⅰ基因在軍曹魚(yú)5個(gè)組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ基因在軍曹魚(yú)肝臟中表達(dá)量最高，在其他組織較低。
　　2.軍曹魚(yú)類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-Ⅰ原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建
　　根據(jù)分析得到的軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ成熟肽序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到軍曹魚(yú)IGF-Ⅰ成熟肽，采用pEASY無(wú)縫克隆技術(shù)將其克隆到pEASY載體上構(gòu)建pEASY-IGF-Ⅰ重組質(zhì)粒，測(cè)序正確后，插入表達(dá)載體pET-21a，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta(DE3)pLysS

5、中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)菌液產(chǎn)生重組蛋白。通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其為分子量為8.6kDa的蛋白條帶，經(jīng)過(guò)western blot檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)目的蛋白與His抗體特異性結(jié)合，表明目的基因IGF-Ⅰ在大腸桿菌中成功表達(dá)。產(chǎn)物以包涵體形式存在，可溶性較差，通過(guò)鹽酸胍變性，His-Tag純化和醋酸鈉洗脫復(fù)性得到可溶性體外重組的目的蛋白。
　　3.軍曹魚(yú)進(jìn)食不同糖水平飼料對(duì)IGF-Ⅰ基因組織表達(dá)的影響
　　以糊精為糖源設(shè)