軍曹魚類胰島素生長因子-Ⅰ的克隆、表達(dá)及其原核表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本論文以軍曹魚為研究對象，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)，成功克隆了軍曹魚類胰島素生長因子-Ⅰ(Insulin-like GrowthsFactors-Ⅰ，IGF-Ⅰ)基因序列，并對該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析和功能鑒定，同時研究了不同飼料糖水平對軍曹魚IGF-Ⅰ基因組織特異性表達(dá)的影響，進(jìn)而通過質(zhì)粒重組技術(shù)構(gòu)建了軍曹魚IGF-Ⅰ體外原核表達(dá)系統(tǒng)，并成功獲得重組蛋白，為深入研究IGF-Ⅰ基

2、因?qū)姴荇~的成長和代謝調(diào)控，提供了堅實的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。實驗結(jié)果如下:
　　1.軍曹魚類胰島素生長生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ) cDNA克隆和序列分析
　　根據(jù)已經(jīng)克隆出的鱸形目魚類IGF-Ⅰ基因序列設(shè)計簡并引物，采用PCR技術(shù)成功克隆了軍曹魚類胰島素生長因子-Ⅰ序列。其cDNA序列長558bp，編碼185個氨基酸，其中信號肽含有44個氨基酸，成熟肽含有67個氨基酸，IGF-Ⅰ mRNA屬于Ea-4亞型。預(yù)測分子量為8.5

3、8 kDa，理論等電點為7.4。同源氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，軍曹魚IGF-Ⅰ成熟肽結(jié)構(gòu)和人類一樣，都包括B、C、A、D區(qū)，其中B區(qū)和A區(qū)保守性較高，C區(qū)和D區(qū)保守性較差。軍曹魚IGF-Ⅰ基因與人類的同源性高達(dá)74％，與黃鰭棘鯛的同源性高達(dá)99％。采用泊松校正法構(gòu)建的IGF-Ⅰ系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，軍曹魚IGF-Ⅰ跟海洋魚類親緣性較近，跟淡水魚類和無脊椎動物親緣性較遠(yuǎn)。通過實時熒光定量PCR(Real Time PCR，RT-PCR)方法，檢測

4、分析IGF-Ⅰ基因在軍曹魚5個組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-Ⅰ基因在軍曹魚肝臟中表達(dá)量最高，在其他組織較低。
　　2.軍曹魚類胰島素生長因子-Ⅰ原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建
　　根據(jù)分析得到的軍曹魚IGF-Ⅰ成熟肽序列設(shè)計引物，克隆得到軍曹魚IGF-Ⅰ成熟肽，采用pEASY無縫克隆技術(shù)將其克隆到pEASY載體上構(gòu)建pEASY-IGF-Ⅰ重組質(zhì)粒，測序正確后，插入表達(dá)載體pET-21a，轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株Rosetta(DE3)pLysS

5、中進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)菌液產(chǎn)生重組蛋白。通過SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)其為分子量為8.6kDa的蛋白條帶，經(jīng)過western blot檢測后發(fā)現(xiàn)目的蛋白與His抗體特異性結(jié)合，表明目的基因IGF-Ⅰ在大腸桿菌中成功表達(dá)。產(chǎn)物以包涵體形式存在，可溶性較差，通過鹽酸胍變性，His-Tag純化和醋酸鈉洗脫復(fù)性得到可溶性體外重組的目的蛋白。
　　3.軍曹魚進(jìn)食不同糖水平飼料對IGF-Ⅰ基因組織表達(dá)的影響
　　以糊精為糖源設(shè)