人SLC真核表達(dá)載體的構(gòu)建，表達(dá)及其效應(yīng)研究.pdf

1、次級淋巴樣組織趨化因子(secondary lymphoid tissue chemokine，SLC)最早發(fā)現(xiàn)是一種T細(xì)胞特異性趨化因子，對NK細(xì)胞和成熟的DC也具有一定的趨化作用。T、NK細(xì)胞和DC在機(jī)體抗腫瘤免疫中重要的作用。研究表明，缺乏鼠SLC的小鼠T細(xì)胞歸巢和DC定位發(fā)生障礙，次級淋巴組織結(jié)構(gòu)功能紊亂。近期研究發(fā)現(xiàn)，SLC受體CCR7表達(dá)于初始T細(xì)胞、B細(xì)胞、DC細(xì)胞及黑色素瘤細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞等多種惡性腫瘤細(xì)胞表面，淋

2、巴結(jié)部位SLC與其受體CCR7的結(jié)合，可促使細(xì)胞向淋巴結(jié)等次極細(xì)胞組織移動，與淋巴細(xì)胞歸巢有關(guān)。因此，SLC及其受體極富潛力成為自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)及腫瘤藥物設(shè)計的新型靶點(diǎn)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)SLC蛋白能夠抑制腫瘤生長，并且能夠促進(jìn)外周血淋巴細(xì)胞有一定程度的增殖。 目的：本實(shí)驗(yàn)采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建人SLC真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，檢測SLC在細(xì)胞中的表達(dá)，隨后檢測其對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的作用及對PB

3、MC的影響，為進(jìn)一步研究SLC的作用機(jī)制及相關(guān)疾病應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。 方法： 1．人SLC真核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá) （1）人SLC基因表達(dá)載體的構(gòu)建及測序 以本室已有SLC-RFP為模板，體外PCR擴(kuò)增基因SLC片斷，質(zhì)粒pgenesil-8、SLC回收產(chǎn)物雙酶切后，回收片斷進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pgenesil-8-SLC，經(jīng)酶切鑒定及測序分析證實(shí)，所克隆和構(gòu)建的SLC cDNA閱讀框及連接部位序列正確；

4、 （2）人SLC真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7及其表達(dá) 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF-7，24小時后通過倒置熒光顯微鏡可觀察到細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá)；western blot檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞24-72小時的培養(yǎng)上清。結(jié)果表明，SLC-GFP以分泌型形式表達(dá)，并在轉(zhuǎn)染后72小時達(dá)到高峰； 2．轉(zhuǎn)染SLC對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 實(shí)驗(yàn)分組 1）空白組：MCF-7 2）轉(zhuǎn)染空載pgenesil8-GFP的

5、MCF-7對照組：MCF-7-vector 3）轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7實(shí)驗(yàn)組：MCF-7-SLC 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染的SLC對腫瘤細(xì)胞凋亡作用，結(jié)果表明轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染SLC及轉(zhuǎn)染空載的MCF-7相比，能顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡。 3．轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7對PBMC增殖作用 實(shí)驗(yàn)分組 1）空白對照組：PBMC以培養(yǎng)基刺激 2）MCF-7刺激組：未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的MCF-7刺

6、激PBMC 3）MCF-7-vector：轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7刺激PBMC 4）MCF-7-SLC：轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7刺激PBMC 以正常人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）為反應(yīng)細(xì)胞，以經(jīng)絲裂霉素C處理的MCF-7、轉(zhuǎn)染空載體的MCF-7及轉(zhuǎn)染SLC的MCF-7作為刺激細(xì)胞，不同的刺激細(xì)胞分別與PBMC以1:5比例混合培養(yǎng)5天后流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明MCF-7-SLC能促進(jìn)PBMC的增殖。 結(jié)論：成功