人可溶性轉(zhuǎn)化生長因子βⅡ型受體重組腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的:糖尿病腎病(DN)是糖尿病全身性微血管并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致終末期腎病的主要因素.在高血糖條件下,腎小球系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分合成和分解代謝的紊亂直接導(dǎo)致了糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展.眾多研究表明過度表達(dá)的轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的活性介導(dǎo)了高血糖對腎臟的作用,且可能是DN發(fā)展的主要決定因素.在高血糖環(huán)境中抑制或下調(diào)TGF-β信號的治療策略提供了一個(gè)抑制DN發(fā)生、發(fā)展的方法. 可溶性TGF-βⅡ型受體(s

2、TβRⅡ)為TGF-βⅡ型受體胞外段,能與TGF-βRⅡ競爭性結(jié)合TG-β,阻斷其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,從而抑制TGF-β的生物學(xué)活性,改善腎功能. 為更好地揭示在高血糖環(huán)境中應(yīng)用sT B R Ⅱ?qū)GF-β活性、腎小管間質(zhì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積聚及組織纖維化的抑制作用,并探討利用sTBRⅡ基因轉(zhuǎn)染防治DN的可能性,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了sTβRⅡ重組腺病毒載體,為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ). 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和方法: 以姚航平研究員提供的sT

3、βRⅡ質(zhì)粒為模板,以Platinum酶擴(kuò)增含SalⅠ/xhoⅠ酶切位點(diǎn)的sTβRⅡ基因序列,然后與TA質(zhì)粒連接后進(jìn)行鑒定. 通過SalⅠ和XhoⅠ雙酶切TA-sTβRⅡ質(zhì)粒和PSI空載體(腺病毒穿梭載體),純化、回收后由T4 DNA連接酶連接過夜,并轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)菌中,37‘C孵育過夜.通過PCR和雙酶切鑒定挑取陽性克隆(PSI-sTβRⅡ).將正確質(zhì)粒用PmeⅠ酶切線性化后割膠純化回收,采用電轉(zhuǎn)化的方法將含sTβRⅡ的

4、穿梭載體轉(zhuǎn)入BJ5183-AD-1感受態(tài)細(xì)菌中,涂板(卡那霉素抗性)后37℃孵育過夜.挑取克隆擴(kuò)增,抽提質(zhì)粒并經(jīng)PCR、酶切鑒定. 擴(kuò)增鑒定正確的腺病毒載體質(zhì)粒,用PacⅠ酶切純化后,應(yīng)用她S轉(zhuǎn)染試劑盒將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入50﹪-7096融合的AD-293細(xì)胞中.當(dāng)出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)時(shí)收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清,-70℃-37℃反復(fù)凍融3次,劇烈振蕩后離心收集上清,-70℃?zhèn)溆?用原代病毒上清繼續(xù)感染AD-293細(xì)胞,以形成第二代病毒,并觀察熒光細(xì)

5、胞數(shù),進(jìn)行Western-blot檢測和重組蛋白對TGFβ1的拮抗活性的檢測. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1、獲得人sTβRⅡ基因片段及TA-sTβRⅡ質(zhì)粒. 利用Platihum酶擴(kuò)增出含SalⅠ/xhoⅠ酶切位點(diǎn)的sTβRⅡ序列,與TA質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化入DH5 d獲得TA-sTβRⅡ質(zhì)粒,PCR和酶切產(chǎn)物于1.2﹪瓊脂糖凝膠電泳顯示片段在500bp左右.測序結(jié)果表明序列正確. 2、成功構(gòu)建PSC-IRES-hrGFP

6、-1-sTβRⅡ(以下簡稱PSI-sTβRⅡ)穿梭載體質(zhì)粒雙酶切后的sTβRⅡ片段和PSI進(jìn)行連接,獲得PSI-sTβRⅡ,經(jīng)PCR和雙酶切后電泳顯示有500bp左右的條帶. 3、成功構(gòu)建人sTβRⅡ重組腺病毒質(zhì)粒(AD-sTβRⅡ)PSI-sTβRⅡ經(jīng)電轉(zhuǎn)化入BJ5183-AD-1細(xì)菌中后獲得AD-sTβRⅡ質(zhì)粒,經(jīng)PCR和雙酶切后電泳顯示有500bp左右的條帶. 4、重組腺病毒質(zhì)粒在AD-293細(xì)胞中包裝及第二代病毒

7、感染結(jié)果重組腺病毒質(zhì)粒用MBs轉(zhuǎn)染試劑盒將其轉(zhuǎn)入AD-293細(xì)胞中,至細(xì)胞培養(yǎng)第13天,90﹪的AD-293細(xì)胞出現(xiàn)病變效應(yīng),收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清.-70℃-37℃反復(fù)凍融、振蕩、離心后取上清感染AD-293細(xì)胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察有無熒光細(xì)胞,并再次收集細(xì)胞與病毒.出現(xiàn)熒光細(xì)胞、Western-blot檢測出現(xiàn)特異性條帶和重組蛋白拮抗TGFβ1對MvlLu細(xì)胞的生長抑制作用,證明包裝病毒為有活性的病毒. 結(jié)論: 1、