腦膠質(zhì)瘤光學和磁共振雙報告基因成像系統(tǒng)的構建.pdf

1、目的：構建腦膠質(zhì)瘤光學和磁共振成像雙報告基因慢病毒系統(tǒng)，在體內(nèi)外驗證目的蛋白的表達，并進一步檢測目的蛋白的成像功能。
　　方法：首先構建 FTH-EGFP-GV287慢病毒載體，進行慢病毒包裝與生產(chǎn)，轉(zhuǎn)染構建穩(wěn)定表達鐵蛋白重鏈、綠色熒光蛋白的細胞株F98-FTH-EGFP及僅表達綠色熒光蛋白的細胞株F98-EGFP，體內(nèi)外驗證FTH及其標記蛋白FLAG的表達，細胞及小動物水平驗證光學成像的可行性，細胞及小動物水平驗證鐵蛋白儲存鐵的

2、功能，驗證MRI成像的可行性。
　　結果：將構建的光學和磁共振成像雙報告基因慢病毒轉(zhuǎn)染細胞后，通過免疫組化、WB、免疫熒光驗證細胞成功的表達了EGFP與FTH。通過熒光顯微鏡與小動物光學成像儀，驗證了體內(nèi)外光學成像的可行性。但是在進行鐵蛋白功能驗證時，得到的是陰性結果，通過普魯士藍染色、原子吸收法均未檢測到轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)鐵的富集，體內(nèi)外MRI上未檢測到局部T2WI信號的下降。
　　討論：雖然我們通過免疫熒光、免疫組化檢測到了鐵

3、蛋白重鏈的過表達，但在鐵蛋白儲存鐵功能驗證時，我們得到的是陰性結果，通過閱讀文獻與相關陽性結果對比，考慮是由于在實驗設計時，為了能夠更好的、特異性更高的檢測到過表達的鐵蛋白，我們在鐵蛋白重鏈的C端添加了一個3FLAG片段，這是由25個氨基酸所構成的標簽蛋白，具有親水性，影響了鄰近的亞鐵氧化酶的活性，使過表達的鐵蛋白重鏈失去氧化亞鐵離子的能力，不能儲存鐵離子。我們后續(xù)又構建了一個不帶標簽蛋白的過表達鐵蛋白重鏈的質(zhì)粒，用293T初步驗證了實