二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對Lewis肺癌的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、惡性腫瘤是威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，其治療失敗的原因之一是對抗癌藥物產(chǎn)生耐藥性。惡性腫瘤耐藥性的產(chǎn)生除了癌細(xì)胞基因易發(fā)生變異外，另一個重要原因是腫瘤組織微環(huán)境異常。這種異常的微環(huán)境形成的機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為與腫瘤組織內(nèi)新生血管結(jié)構(gòu)和功能嚴(yán)重缺陷造成組織內(nèi)間隙液體壓升高、低氧環(huán)境和酸中毒等因素有關(guān)。以VEGF為靶點(diǎn)的藥物可以通過阻礙VEGF通路而被動的修剪不成熟的腫瘤血管，使血管結(jié)構(gòu)盡可能趨向為正常結(jié)構(gòu)．從而使得腫瘤間質(zhì)液體壓力

2、減少，增加腫瘤內(nèi)氧氣的輸送，同時使更多的藥物滲透進(jìn)入腫瘤，可以增強(qiáng)化療藥物的治療作用。雖然腫瘤的治療已達(dá)到多樣化，但化學(xué)治療在腫瘤治療中仍占有重要地位。在未來若干年中化學(xué)治療仍將是腫瘤治療的主要手段，因此對于化療增敏劑的研究開發(fā)已成為當(dāng)前腫瘤治療學(xué)中重要課題。 青蒿素(artemisinin)是由我國學(xué)者從植物黃花蒿Artemisia annua Linn中提取的一種高效低毒抗瘧藥。二氫青蒿素為青蒿素類藥物的體內(nèi)主要代謝物。近年

3、來研究報道二氫青蒿素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，我們前期研究表明，二氫青蒿素可有效抑制人卵巢癌裸鼠移植癯組織及惡性血液腫瘤細(xì)胞株K562、RPlm8226中VEGF的表達(dá)，具有潛在的抗血管生成作用。而對于其能否增強(qiáng)化療藥物的治療效果，則未見報道。本論文采用C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植癯模型研究二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對Lewis肺癌生長和轉(zhuǎn)移的治療作用，同對以vEGF及其受體為靶標(biāo)，從細(xì)胞分子水平研究其增強(qiáng)化療藥物治療作用的可能機(jī)制，為

4、開拓二氫青蒿素的臨床價值提供藥理學(xué)依據(jù)。 二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對Lewis肺癌生長和轉(zhuǎn)移的治療作用 1.1對小鼠移植瘤生長的影響在C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤動物模型中，二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺用藥各組腫瘤生長速度緩慢，在治療結(jié)束后腫瘤重量較溶劑對照組明顯減少(P<0.05)。表明二氫青蒿素可增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對Lewis肺癌生長的治療作用。同時在相同劑量的二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺給藥組，由于聯(lián)合給藥的時間點(diǎn)不同而表現(xiàn)

5、出對腫瘤生長抑制作用的不同：與腫瘤接種后第5天開始實施化療方案相比,腫瘤接種后第7天實施化療方案有較好的治療效果。 1.2藥物的毒副作用用藥過程中，各組荷瘤鼠活動良好，未見特殊不良反應(yīng)，無一例死亡．用藥25天后溶劑對照組小鼠去瘤體重與合用各組小鼠去瘤體重比較無顯著差異。說明在本實驗給藥方案下,藥物對小鼠沒有明顯的毒副作用。 1.3對荷瘤小鼠肺轉(zhuǎn)移的影響在皮下移植瘤模型中，發(fā)現(xiàn)溶劑對照組小鼠大部分出現(xiàn)自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移，單用DH

6、A、CTX組肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)較溶劑對照組有不同程度下降，二氫青蒿素聯(lián)合環(huán)磷酰胺治療則可以完全抑制腫瘤自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移。 2.二氫青蒿素體外抑制Lewis肺癌細(xì)胞株生長及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 2.1體外抑制LLC細(xì)胞增殖體外培養(yǎng)小鼠肺癌細(xì)胞株(Lewis lung carcinoma，LLc)，用二氫青蒿素作用48小時，MTT法檢測，其生長被明顯抑制，二氫青蒿素抑制LLc生長的IC50為53.14μmol.L-1，95％置信區(qū)間為48.

7、69-58.18μmol.L-1。 2.2二氫青蒿素誘導(dǎo)LLc細(xì)胞凋亡LLc細(xì)胞經(jīng)AO/EB染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，可見溶劑對照組表現(xiàn)正常細(xì)胞的染色特征，而經(jīng)80μmol.L-1的二氫青蒿素作用48小時后的細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡的典型形態(tài)學(xué)改變，如染色質(zhì)凝集，凋亡小體形成等。 2.3二氫青蒿素誘導(dǎo)的LLC細(xì)胞捅亡的流式定量分析經(jīng)流式細(xì)胞儀分析，根據(jù)PI熒光直方圖顯示，LLc細(xì)胞經(jīng)20μmol.L-1二氫青蒿素作用48h后

8、，細(xì)胞凋亡百分率沒有明顯增加，經(jīng)40，80 μmol.L-1二氫青蒿素作用48h后。GI峰前出現(xiàn)了代表凋亡細(xì)胞的亞二倍體蜂，細(xì)胞凋亡率分別上升至9.82％和13.86％。 3.二氫青蒿素下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF及其受體的表達(dá) 3.1二氫青蒿素下調(diào)腫瘤組織VEGF蛋白表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測腫瘤組織VEGF蛋白的表達(dá)，以細(xì)胞內(nèi)棕黃色強(qiáng)弱來判斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示。溶劑對照組表現(xiàn)為較強(qiáng)至中等的棕黃色，與溶劑對照

9、組相比,二氫青蒿素組及各聯(lián)合治療組腫瘤細(xì)胞內(nèi)棕黃色明顯減弱。 3.2二氫青蒿素抑制Lc細(xì)胞VEGF受體KDR/fik-1的表達(dá)用Western-blot方法檢測經(jīng)不同濃度的二氫青蒿素處理后LLc細(xì)胞VEGF受體KDR/flk-1蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的增高,細(xì)胞VEGF受體蛋自表達(dá)依次下降80 μmol.L-1濃度組細(xì)胞VEGF受體KDR/flk-1分別降為溶劑對照組的33.8％、12.6％，與溶劑對照組比較存在顯著性差

10、異(p<0.05)。 以上結(jié)果表明：(1)在整體動物模型中，二氫青蒿素增強(qiáng)環(huán)磷酰胺對lewis肺癌的治療作用，有效抑制腫瘤生長，下調(diào)腫瘤組織中VEGF的表達(dá)。(2)體外研究表明，二氫青蒿素能下調(diào)腫瘤細(xì)胞VEGF受體KDR/flk-1的表達(dá)，并誘導(dǎo)LLc細(xì)胞凋亡。根據(jù)以上結(jié)果可以推斷二氫青蒿素能下調(diào)腫瘤細(xì)VEGF及其受體KDR/flk-1的表達(dá)，可能是該類藥物增強(qiáng)化療藥物對Lewis肺癌的治療作用的機(jī)理之一。 結(jié)論:二氫青