二氫青蒿素對人宮頸癌Hela和Siha細(xì)胞輻射敏感性的影響及作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：本課題研究二氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)對p53突變型人宮頸癌HeLa細(xì)胞及p53野生型人宮頸癌Siha細(xì)胞輻射增敏作用及機(jī)制。通過檢測二氫青蒿素的濃度和作用時間對HeLa和Siha細(xì)胞的抑制效應(yīng)，確定用作輻射增敏實驗的藥物濃度及時間；通過研究二氫青蒿素對輻射后HeLa和Siha細(xì)胞增殖能力的影響，探討二氫青蒿素對細(xì)胞輻射敏感性的影響；通過對二氫青蒿素及X-射線作用后細(xì)胞周期以及細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白we

2、el，cyclinB1，cdc2表達(dá)水平的檢測，對二氫青蒿素輻射增敏機(jī)制進(jìn)行研究。并且，比較分析二氫青蒿素對具有不同p53功能的人宮頸癌細(xì)胞輻射增敏作用及作用機(jī)理的差異性。 方法： (1)利用四氮唑鹽比色試驗(MTT)檢測二氫青蒿素對人宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)的影響； (2)應(yīng)用克隆形成法及細(xì)胞凋亡率檢測二氫青蒿素對細(xì)胞輻射敏感性的影響； (3)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測二氫青蒿素及X-射線作用后對細(xì)

3、胞周期的影響； (4)應(yīng)用Western Blot法觀察二氫青蒿素及X-射線作用后對細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)蛋白weel，cyclinBl，cdc2的影響。 結(jié)果： (1)二氫青蒿素對人宮頸癌細(xì)胞的抑制率具有濃度及時間依賴性，其抑制作用隨二氫青蒿素濃度和作用時間的增加而增加； (2)二氫青蒿素對p53功能不同的人宮頸癌細(xì)胞的抑制率不同，當(dāng)人宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞的抑制率均達(dá)到16％左右時，二氫青蒿素作用濃度

4、分別為20μmol/L和100μmol/L； (3)相同二氫青蒿素濃度下，細(xì)胞克隆形成率隨照射劑量增加而減少；二氫青蒿素對p53突變型人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有明顯的輻射增敏作用，對p53野生型人宮頸癌Siha細(xì)胞沒有明顯輻射增敏作用。對于HeLa細(xì)胞，單純照射組和藥物+照射組平均致死劑量(Do)分別為2.32Gy、1.58Gy，準(zhǔn)閾劑量(Dq)分別為1.18Gy、0.59Gy，輻射增敏比(SER)為1.47；對于Siha細(xì)胞，單

5、純照射組和藥物+照射組平均致死劑量(Do)分別為2.26Gy、2.14Gy，準(zhǔn)閾劑量(Dq)分別為1.18Gy、1.00Gy，輻射增敏比(SER)為1.06； (4)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，與單純照射組的16.26％凋亡率相比，HeLa細(xì)胞藥物+照射組的凋亡率升至26.87％，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；對于Siha細(xì)胞，單純照射組和藥物+照射組的凋亡率分別為26.38％和27.55％，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.0

6、5)； (5)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，對于HeLa細(xì)胞，藥物+照射組與單純照射組相比，G0/G1期細(xì)胞比例上升(P<0.01)，G2/M期細(xì)胞比例下降(P<0.01)；對于Siha細(xì)胞，藥物+照射組與單純照射組相比，G0/G1期、G2/M期細(xì)胞均無明顯變化(P>0.05)； (6) Western-blot分析，在HeLa細(xì)胞，藥物+照射組weel蛋白較單純照射組減少，cyclinB1蛋白較單純照射組增加，cdc2蛋

7、白變化不明顯；在Siha細(xì)胞，藥物+照射組weel蛋白、cyclinB1蛋白、cdc2蛋白較單純照射組均變化不明顯。 結(jié)論： (1)二氫青蒿素對人宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞的抑制率隨著二氫青蒿素濃度的增加及作用時間的延長而增加； (2)相同濃度的二氫青蒿素對人宮頸癌HeLa和Siha細(xì)胞的抑制率不同，對HeLa細(xì)胞的抑制率高于Siha細(xì)胞； (3)二氫青蒿素能明顯增加p53突變型宮頸癌細(xì)胞HeLa的輻射

8、敏感性，而對于p53野生型宮頸癌細(xì)胞Siha沒有明顯的輻射增敏作用； (4)二氫青蒿素能增加受照后的人宮頸癌HeLa細(xì)胞的凋亡率；而對于人宮頸癌Siha細(xì)胞，二氫青蒿素聯(lián)合照射組與單純照射組相比凋亡率無明顯變化； (5)二氫青蒿素對HeLa細(xì)胞的輻射增敏作用與其抑制輻射誘導(dǎo)活化的G2/M期阻滯效應(yīng)，使受損細(xì)胞沒有經(jīng)過修復(fù)直接進(jìn)入分裂期而發(fā)生死亡有關(guān)；二氫青蒿素對Siha細(xì)胞無輻射增敏作用與輻射主要誘導(dǎo)Siha細(xì)胞產(chǎn)生G1

9、/S期阻滯，而對G2/M期沒有明顯阻滯效應(yīng)有關(guān)； (6) HeLa細(xì)胞經(jīng)二氫青蒿素聯(lián)合照射后，主要通過誘導(dǎo)weel蛋白表達(dá)降低，cyclinB1蛋白表達(dá)增高，從而減弱輻射誘導(dǎo)的G2/M期阻滯效應(yīng)，發(fā)揮輻射增敏作用；Siha細(xì)胞經(jīng)輻射誘導(dǎo)主要發(fā)生G1/S期阻滯，故二氫青蒿素聯(lián)合照射后，與調(diào)控G2/M期有關(guān)的weel蛋白和cyclinB1蛋白表達(dá)均變化不明顯。 (7) HeLa和Siha細(xì)胞經(jīng)二氫青蒿素聯(lián)合照射后，cdc2蛋