CatSper1 DNA疫苗對雄性小鼠抗生育效果的初步研究.pdf

1、本文分兩個部分進(jìn)行探討:
　　第一部分：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的表達(dá)及引發(fā)的免疫反應(yīng)
　　目的：檢測pEGFP-N1-CatSper1重組質(zhì)粒接種到雄性小鼠體內(nèi)后的表達(dá)及引發(fā)的特異性免疫反應(yīng)。
　　方法：少量提取質(zhì)粒pEGFP-N1-CatSper1，若酶切鑒定結(jié)果正確則進(jìn)行去內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取，測濃度及純度后，調(diào)節(jié)濃度至0.5μg/μl備用。取200μl pEGFP-N1-CatSp

2、er1、PBS肌肉注射于雄性小鼠的雙后肢大腿肌肉處，隔周注射一次，共注射3次。分別在初次免疫后12、24、48h取注射部位組織提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測CatSper1 mRNA的表達(dá)。分別在初次免疫后24、48、72h取注射部位組織做冰凍切片，激光共聚焦顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的熒光以檢測CatSper1蛋白的表達(dá)。通過酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測pEGFP-N1-CatSpe

3、r1注射組小鼠免疫前及初次免疫后1、3、5w的血清中抗CatSper1 IgG抗體的滴度。
　　結(jié)果：pEGFP-N1-CatSper1雙酶切產(chǎn)物中可見兩條分別約為5kb、2kb的條帶，鑒定結(jié)果正確。大量提取的質(zhì)粒的OD260/OD280在1.8-2.0，符合體內(nèi)注射的要求。pEGFP-N1-CatSper1注射組RT-PCR結(jié)果為CatSper1 mRNA陽性，PBS注射組則為陰性。激光共聚焦顯微鏡下，pEGFP-N1-CatS

4、per1注射組細(xì)胞有較強(qiáng)的綠色熒光，PBS注射組僅見少許自發(fā)熒光。pEGFP-N1-CatSper1注射組小鼠血清中可檢測到特異性抗CatSper1 IgG抗體，抗體滴度先逐漸上升，在初次免疫后3w達(dá)到高峰，然后逐漸下降。
　　結(jié)論：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗的目的基因CatSper1可在哺乳動物體內(nèi)正常轉(zhuǎn)錄、翻譯并引發(fā)特異性免疫反應(yīng)。
　　第二部分：pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗對雄性小

5、鼠的抗生育效果
　　目的：研究pEGFP-N1-CatSper1 DNA疫苗對雄性小鼠的抗生育效果。
　　方法：取200μlpEGFP-N1-CatSper1、pEGFP-N1（0.5μg/μl）通過肌肉注射的方法免疫雄性小鼠，隔周注射一次，共注射3次。末次免疫后1w將雄鼠與雌鼠按1:2的比例連續(xù)合籠2w，合籠后8h內(nèi)檢查雌鼠陰栓，查到陰栓后14 d處死雌鼠計(jì)數(shù)宮腔內(nèi)的胚胎數(shù)。交配試驗(yàn)結(jié)束后處死雄鼠，取一側(cè)睪丸、附睪用于觀察

6、其組織結(jié)構(gòu)；取另一側(cè)附睪尾精子，檢測精子濃度、活力及超活化運(yùn)動。
　　結(jié)果：pEGFP-N1-CatSper1注射組小鼠生育率（40.91％）明顯低于pEGFP-N1注射組（P=0.012），但交配率（90.91％）及平均每胎產(chǎn)仔數(shù)（10.9±0.9）與pEGFP-N1注射組無明顯差異。pEGFP-N1-CatSper1注射組小鼠精子前向運(yùn)動率（（36.31±2.43）％）及超活化運(yùn)動率（（8.09±1.23）％）明顯下降（P<0