B7-H1蛋白疫苗對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠HBsAg免疫效果影響的初步研究.pdf

1、全球目前約有3.6億慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染者,其中約有10％左右發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，每年死于HBV所致疾病人數(shù)在50萬(wàn)到120萬(wàn)。免疫系統(tǒng)在HBV慢性感染的病程和轉(zhuǎn)歸中起著至關(guān)重要的作用，慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)患者體內(nèi)免疫功能異常,抗HBV特異性細(xì)胞免疫功能低下，主要表現(xiàn)為抗病毒相關(guān)的細(xì)胞因子分泌低下及病毒在體內(nèi)的持續(xù)存在。近期研究表明，程序性死亡蛋白-1（p

2、rogrammeddeath-1,PD-1）及其配體（B7-H1，即PD-L1）與感染的慢性化有關(guān)，阻斷PD-1與其配體B7-H1（PD-L1）的結(jié)合，可增強(qiáng)T細(xì)胞的抗病毒作用。本研究擬通過(guò)體內(nèi)阻斷PD-1/PD-L1途徑，改善HBsAg免疫刺激HBV轉(zhuǎn)基因小鼠抗HBV免疫功能，為治療慢性乙型肝炎探尋新方法。
　　目的：
　　應(yīng)用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠動(dòng)物模型，觀察B7-H1蛋白疫苗免疫后對(duì)PD-1/PD-L1的阻斷效果及其是否能

3、夠增強(qiáng)對(duì)HBsAg的免疫應(yīng)答。
　　方法：
　?、?5只HBVTg雌性小鼠隨機(jī)分為HBsAg組、重組人B7-H1聯(lián)合HBsAg組、生理鹽水對(duì)照組。②HBsAg組每只小鼠腹腔注射HBsAg200μL(含HBsAg10μg)；B7-H1聯(lián)合HBsAg組腹腔注射HBsAg（含HBsAg10μg）及重組人B7-H1（含B7-H140μg），終體積為200μl；生理鹽水對(duì)照組腹腔注射200μL生理鹽水；各組小鼠每?jī)芍苊庖?注射1次，共

4、4次，末次免疫后2周處死小鼠取脾。③3組小鼠均在免疫前1天及免疫后2、4、6、8周經(jīng)眶后靜脈叢穿刺采血,每次采血0.3～0.5mL，高速離心（13000r/min,10min）后收集上清置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。④記?組小鼠免疫前體重、HBsAg定量，比較各組之間有無(wú)差異。⑤應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)B7-H1蛋白疫苗免疫后2、4、6、8周血清抗體滴度。⑥應(yīng)用HBsAbELISA試劑盒檢測(cè)各試驗(yàn)組產(chǎn)生抗乙肝病毒表面抗原抗體（抗-HBs）的水

5、平。⑦按常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，應(yīng)用HBsAg刺激后觀察各組脾細(xì)胞產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的量。⑧應(yīng)用ELISPOT試劑盒檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組小鼠分泌HBsAg特異性IFN-γT細(xì)胞的數(shù)量。⑨用MTT法檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞增殖功能。⑩在統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS中分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以?x±s表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　?、?組Tg小鼠的平均體重分別為27.2±0.96g、26.6±0.55g、27.1±0.752g；3組小

6、鼠免疫前血清HBsAg滴度分別為5307.9±437.8IU/mL、5335.4±523.5IU/mL和5554.8±439.5IU/mL；3組小鼠無(wú)論是體重還是免疫前HBsAg滴度均未見(jiàn)明顯差異。②B7-H1蛋白疫苗免疫小鼠后，血清抗體滴度隨免疫次數(shù)的增加而升高，并可維持較高的滴度。③免疫治療6周、8周，HBsAg組及HBsAg+B7-H1組均100％出現(xiàn)表面抗原抗體，對(duì)照組始終為陰性，但HBsAg組及HBsAg+B7-H1組兩組之間

7、抗體滴度無(wú)明顯差異（P>0.05）。④HBsAg組及HBsAg+B7-H1組所誘生的Th1類(lèi)細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ）的水平與生理鹽水對(duì)照組相比明顯增高(P<0.05）,IL-2分別為306.7±94.8pg/ml、327.9±109.6pg/ml、124.5±55.7pg/ml，IFN-γ分別為569.0±132.1pg/ml、647.8±161.8pg/ml、99.2±50.2pg/ml，但HBsAg組及HBsAg+B7-H1

8、組之間無(wú)顯著性差異（P>0.05）。⑤HBsAg單獨(dú)免疫及HBsAg+B7-H1聯(lián)合免疫組小鼠脾細(xì)胞HBsAg特異性分泌IFN-γT細(xì)胞數(shù)量較生理鹽水對(duì)照組增加近1倍（P<0.05），分別為57.8±5.4、52.4±4.5、23.6±3.6,但HBsAg與HBsAg+B7-H1兩組間無(wú)明顯差異（P>0.05）。⑥淋巴細(xì)胞特異性增殖試驗(yàn)中，HBsAg組及HBsAg+B7-H1組刺激指數(shù)（SI）明顯高于生理鹽水對(duì)照組，分別為2.29±0.

9、30、2.30±0.36和1.33±0.26，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而HBsAg組與HBsAg+B7-H1組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、HBsAg可以誘導(dǎo)乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生特異性的體液免疫，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平Th1類(lèi)細(xì)胞因子（IL-2、IFN-γ），打破免疫耐受。
　　2、應(yīng)用B7-H1蛋白疫苗阻斷PD-1/PD-L1對(duì)HBsAg在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的免疫效果無(wú)明顯影響，但仍需