雙表達HBV-S DNA疫苗免疫效果研究.pdf

1、目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染是一個世界性的公共衛(wèi)生問題。目前最有效的預防和控制乙型肝炎病毒感染的措施就是接種乙型肝炎疫苗。常規(guī)使用的乙型肝炎疫苗，由于免疫原性弱，在制備時加入鋁劑，雖然體液免疫應答得到加強，但鋁劑抑制機體的細胞免疫，因而常規(guī)疫苗接種后只能產(chǎn)生較好的預防作用，基本不具備治療功效。而且，常規(guī)疫苗即使按照0、1、6月程序對健康者進行全程免疫后，仍然有5％一lO％的接種者血清抗-HBs始終陰性或達不到保護閾值，成為乙型肝炎病

2、毒的易感者。HBV-SDNA疫苗兼具預防和治療作用，但因其引發(fā)機體的免疫應答弱，目前還不能應用于臨床。本實驗為增強HBV-SDNA疫苗的免疫應答效果，進一步探索HBV-SDNA疫苗在預防和治療慢性乙型肝炎領域的可行性。 方法：PCR擴增目的基因片段S1和S2，分別T-A克隆到pMDl8-TS載體中，構建pMDl8-TS-S1和pMDl8-TS-S2并測序。將pMDl8-TS-S1中目的基因片斷S1定向克隆到質粒pVITR03-M

3、CS中，構建pVITR03一S1；將pMDl8-TS-S2中目的基因片斷S2定向克隆到質粒pVITR03-MCS中，構建pVITR03一S2；再將pMDl8-TS-S2中目的基因片斷S2定向克隆到質粒pVITR03一S1中，構建pVITR03．S1S2。用脂質體將對照質粒pVITR03-mcs、表達質粒pVITR03一Sl、pVITR03一S2和pVITR03一S1S2分別轉染HepG2細胞，以潮霉素篩選獲得抗性克隆，檢測細胞上清液HB

4、sAg表達。將對照質粒pVITR03-mcs、表達質粒pVITR03一S1、pVITR03一S2和pVITR03一S1S2分別免疫接種BALB／C小鼠，檢測小鼠血清中的抗-HBs。 結果：通過限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定和核酸序列分析鑒定，我們成功構建了質粒pMDl8-TS—S1、pMDl8-TS-S2和表達質粒pVITR03．S1、pVITR03一S2以及pVITR03一S1S2。體外實驗表明，轉染質粒pVITR03-mcs的He

5、pG2細胞在第24h、48h和72h細胞上清液HBsAgS／N值分別為：1．75±0．06，1．82±O．10，1．79±O．12；轉染表達質粒pVITR03一S1的HepG2細胞在第24h、48h和72h細胞上清液HBsAgS／N值分別為：3．98±0．56，9．06±0．95，10．28±0．36；轉染表達質粒pVITR03一S2的HepG2細胞在第24h、48h和72h細胞上清液HBsAgS／N值為：4．02±0．26，9．60±

6、0．51，¨．07±0．52；轉染表達質粒pVITR03．S1S2的HepG2細胞在第24h、48h和72h細胞上清液HBsAgS／N值為：7．67±0．50，16．78±0．52，18．19±1．03。小鼠體內(nèi)實驗表明，接種質粒pVITR03-mcs的小鼠血清抗-HBs陽轉率為O；接種表達質粒pVITR03一S1的小鼠血清抗-HBs陽轉率為50％；接種表達質粒pVITR03．S2的小鼠血清抗-HBs陽轉率為58．3％；接種表達質粒pV

7、ITR03．S1S2的小鼠血清抗-HBs陽轉率833％。同時，在抗-HBs陽轉小鼠中，接種表達質粒pVITR03一S1的小鼠血清抗-HBs濃度為15．78±3~89mIU／ml；接種表達質粒pVITR03一S2的小鼠血清抗-HBs濃度為16．32±4．76mIU／ml；接種表達質粒pVITR03一S1S2的小鼠血清抗-HBs濃度為23．81±8．11mIU／ml。 結論：體外實驗表明，轉染質粒pVITR03-mcs的HepG2細

8、胞不能表達HBsAg；轉染質粒pVITR03一Sl、pVITR03一S2和pVITR03一S1S2的HepG2細胞能表達HBsAg，但轉染表達質粒pVITR03一S1S2的HepG2細胞HBsAg表達量明顯高于轉染表達質粒pVITR03一S1和pVITR03一S2的HepG2細胞的表達量。體內(nèi)實驗表明，接種質粒pVITR03-mcs的小鼠不能產(chǎn)生具有保護性濃度的抗-HBs；接種表達質粒pVITR03一S1、pVITR03一S2和pVIT