HSV-2多表位復(fù)合DNA疫苗的構(gòu)建與誘導(dǎo)小鼠免疫效果的研究.pdf

1、目的 構(gòu)建單純皰疹病毒2型(HSV-2)糖蛋白gD、gB、gC和早期表達(dá)蛋白ICP 27的多表位復(fù)合DNA疫苗和免疫佐劑IL2質(zhì)粒，以及在復(fù)合疫苗質(zhì)粒基礎(chǔ)上修飾的信號肽質(zhì)粒與泛素化質(zhì)粒，并探討其誘導(dǎo)小鼠機(jī)體免疫應(yīng)答的能力。 方法 國內(nèi)HSV-2野生株經(jīng)PCR鑒定后利用PCR技術(shù)從其基因組中擴(kuò)增出HSV-2ICP27 377-459、gD146-179、gD223-306、gB529-606、gC247-282、g

2、D1-77六個基因片段，PCR鑒定后按先后順序，采用多基因片段一步酶切連接法獲得HV融合基因片段，經(jīng)pGEMT載體克隆后定向插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1 載體中，構(gòu)建出重組真核表達(dá)質(zhì)粒HV- pcDNA3.1，并對其進(jìn)行酶切分析及測序鑒定。 PCR擴(kuò)增gD146 179信號肽片段，進(jìn)一步酶切連接構(gòu)建重組質(zhì)粒gDs IIV hiSpcDNA3.1，并對其進(jìn)行酶切分析及測序鑒定。 PCR擴(kuò)增人基因組DNA和HSV-2基因

3、組中泛素全長基因和HSV-2 ICP27377-459，酶切連接獲得融合基因片段，插入真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1載體中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒Ub- ICP -pcDNA3.1，并對其進(jìn)行酶切分析及測序鑒定。 PCR擴(kuò)增人IL-2信號肽基因和人IL-2尾段基因，取上述兩段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為融合PCR的模板，擴(kuò)增IL-2 cDNA全長基因，連入pcDNAu3.1質(zhì)粒中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒IL-2-pcDNA3.1，并對其進(jìn)行酶切分析及測序鑒

4、定。 C57/BL6雌性6周齡小鼠40只，隨機(jī)分為8組，每組均5只，根據(jù)免疫的質(zhì)粒類型和免疫方式的不同，各組依次為pcDNA3.1(空質(zhì)粒對照)、HV-pcDNA3.1、HV-pcDNA3.1+IL2-pcDNA3.1、gDs-HV-hiS-pcDNA3.1、gDs-HV-hiS-pcDNA3.1+ IL2-pcDNA3.1、Ub-ICP-pcDNA3.1和HV-pcDNA3.1、HV-pcDNA3.1 +IL2-pcDNA3.

5、1。 免疫前先用特異性抗原刺激，前6組小鼠每只用5ug的相應(yīng)質(zhì)粒(與IL2共表達(dá)的組用5+5ug的量)和1ug的脂質(zhì)體充分混合，20min后轉(zhuǎn)染到同批次C57/BL6雌性鼠脾淋巴細(xì)胞中，37℃、5％CO<,2>培養(yǎng)4h后注射入小鼠皮下；后2組小鼠也用5ug的相應(yīng)質(zhì)粒(與IL2共表達(dá)的組用5+5ug的量)直接注射到雙側(cè)脛骨前肌中。14天后正式免疫，前6組小鼠每只用100ug的相應(yīng)質(zhì)粒(與IL2共表達(dá)的組用100+100ug的量)和

6、10ug的脂質(zhì)體充分混合，20min后注入小鼠雙側(cè)脛骨前肌中；后2組小鼠也用100ug的相應(yīng)質(zhì)粒(與IL2共表達(dá)的組用100+100ug的量) 直接注入小鼠雙側(cè)脛骨前肌中。14天后再加強(qiáng)免疫一次，方法和劑量與正式免疫完令一致。加強(qiáng)免疫后3周小鼠斷尾取血，分離血清。斷頸處死小鼠取脾，分離淋巴細(xì)胞。ELISA檢測小鼠血清HSV-2特異性IgG、IL-2和IFN-γ，MTT法檢測小鼠脾T淋巴細(xì)胞特異性增殖，乳酸脫氫酶法檢測殺傷性T淋巴細(xì)胞(C

7、TL)功能和流式細(xì)胞儀檢測CD4+/CD8+T細(xì)胞亞群分類。 結(jié)果 構(gòu)建的HV-pcDNA3.1質(zhì)粒、IL2-pcDNA3.1質(zhì)粒、Ub-ICP-pcDNA3.1質(zhì)粒、gDs-HV-his-pcDNA3.1質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定并進(jìn)行DNA測序，測序結(jié)果正確，表明已成功構(gòu)建出HSV-2多表位復(fù)合DNA疫苗。 免疫小鼠后實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：gDs-HV-his-pcDNA3.1與IL2-pcDNA3.1 聯(lián)合免疫后體液免疫最強(qiáng)，

8、特異性IgG效價達(dá)到400倍左右；T細(xì)胞表面信號分子CD4的陽性率與空載體pcDNA3.1組相比有顯著差異(P<0.05)。而HV-pcDNA3.1與IL2-pcDNA3.1 聯(lián)合免疫后細(xì)胞免疫水平最強(qiáng)，特異性T淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)SI達(dá)到2.75左右，而空質(zhì)粒對照組為0.7左右；淋巴細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)CTL反應(yīng)的殺傷率 (效靶比為 50∶1時)接近50％，而空質(zhì)粒對照組為8％左右；T 細(xì)胞表面信號分子CD8的陽性率與空載體 pcDNA3.1

9、組相比也有顯著差異(P<0.05)，但 CD4<'+>/CD8<'+>的值無顯著差異(P>0.05)；血清中細(xì)胞因子IL2和IFN-γ含量檢測結(jié)果顯示：IL2水平(ng/L)為1421.16±220.98，而空質(zhì)粒對照組為 685.21±104.20；IFN-γ水平(ng/L)為1956.19±219.60，而空質(zhì)粒對照組為547.71±189.33。 另一組有關(guān)不同免疫方式比較的實(shí)驗(yàn)總體上看則說明了脂質(zhì)體包裹的 DNA疫苗比單

10、純的裸DNA注射法能顯著提高免疫活性，若用脂質(zhì)體包裹起來同時轉(zhuǎn)染IL2質(zhì)粒和復(fù)合疫苗質(zhì)粒則更強(qiáng)。 結(jié)論 1．成功構(gòu)建了HSV-2多表位復(fù)合DNA疫苗，包括質(zhì)粒HV-pcDNA3.1、信號肽質(zhì)粒gDs-HV-his-pcDNA3.1、泛素化質(zhì)粒Ub-ICP-pcDNA3.1和佐劑質(zhì)粒IL2-pcDNA3.1。 2．小鼠動物實(shí)驗(yàn)表明，我們構(gòu)建的疫苗質(zhì)粒HV- pcDNA3.1和信號肽質(zhì)粒gDs-HV-his-pcDN

11、A3.1 能有效誘導(dǎo)小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，與佐劑質(zhì)粒IL2-pcDNA3.1 共同免疫效果更強(qiáng)。信號肽質(zhì)粒gDs.HV-his-pcDNA3.1與佐劑質(zhì)粒IL2-pcDNA3.1共注射誘導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)最強(qiáng)，而質(zhì)粒HV-pcDNA3.1與佐劑質(zhì)粒IL2-pcDNA3.1共注射誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)最強(qiáng)。 3．質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體包裹并在免疫前通過淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染小鼠皮下預(yù)注射方法比單純裸質(zhì)粒注射方法能明顯提高體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。