甘露糖受體及TLR4信號通路在尼古丁增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞抗原交叉提呈中的作用.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DCs)是表達(dá)乙酰膽堿N型受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAchR)的抗原提呈細(xì)胞(antign presenting cell，APC)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，尼古丁可調(diào)控小鼠骨髓來源的DCs表面nAchR及CD80/86等分子表達(dá)而增強(qiáng)DCs介導(dǎo)的CTL應(yīng)答，尼古丁刺激DCs所表現(xiàn)的抗腫瘤效應(yīng)提示尼古丁可調(diào)控DCs的交叉提呈能力。甘露糖受體(Mannos

2、e receptor,MR)是DCs表面重要的模式識別受體，DCs對抗原的交叉提呈不僅依賴于MR介導(dǎo)的抗原內(nèi)吞而且也依賴于TLR4通路活化所致的TAP內(nèi)體轉(zhuǎn)位。但到目前為止，尚不清楚MR及TAP內(nèi)體轉(zhuǎn)位在尼古丁調(diào)控DCs交叉提呈中作用，尼古丁對人DCs是否也有類似的調(diào)控作用也有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。為此，本課題先以流式細(xì)胞術(shù)、Western Blot檢測尼古丁對DCs表面MR、TLR4表達(dá)的影響;次以通路抑制劑阻遏相應(yīng)激酶活性，流式細(xì)胞術(shù)、W

3、estern Blot發(fā)現(xiàn)尼古丁調(diào)控MR、TLR4機(jī)制;繼以激光共聚焦顯微鏡結(jié)合基因沉默技術(shù)觀察MR、TLR4信號活化在尼古丁增強(qiáng)DCs交叉提呈中的作用;最后以人外周血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DCs，進(jìn)一步驗(yàn)證尼古丁對DCs表面分子的調(diào)控作用及其機(jī)制，為尼古丁調(diào)控DCs的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　結(jié)果顯示:尼古丁刺激不僅明顯增加DCs表面MR和TLR4分子的表達(dá)并將DCs的吞噬能力提高約160％，而且也明顯上調(diào)CD80和4-1BBL分子的表

4、達(dá)，而nAchR特異性和非特異性拮抗劑α-銀環(huán)蛇毒素和筒箭毒堿則明顯逆轉(zhuǎn)尼古丁對CD80、4-1BBL的上調(diào)作用，提示尼古丁經(jīng)nAchR上調(diào)DCs表面MR、CD80、4-1BBL分子表達(dá);對信號激酶磷酸化的檢測顯示，尼古丁在5-15分鐘明顯引起ERK1/2磷酸化，PI3K激酶的磷酸化也在尼古丁刺激5-30分鐘出現(xiàn)。而以LY294002和Wortmannin抑制相應(yīng)激酶活性后，尼古丁對TLR4和MR分子的上調(diào)作用消失，提示尼古丁經(jīng)PI3K

5、-Akt通路上調(diào)DCs表面TLR4和MR表達(dá);激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，尼古丁刺激不僅增強(qiáng)OVA與早期內(nèi)體標(biāo)志分子EEA1共定位，也促進(jìn)MR與EEA1的共定位，而MR基因沉默則顯著抑制OVA-EEA1的共定位，提示尼古丁經(jīng)調(diào)控MR表達(dá)而促進(jìn)內(nèi)吞抗原OVA定位于內(nèi)體;對DCs交叉提呈產(chǎn)物SIINFEKL-H2Kb的激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)檢測則發(fā)現(xiàn)，尼古丁刺激不僅增加SIINFEKL與EEA1、Rab7、MHCⅠ類分子共定位，也促進(jìn)MHCⅠ

6、類分子與EEA1、Rab7的共定位和SIINFEKL-H2Kb復(fù)合物的形成，而沉默MR表達(dá)則SIINFEKL與EEA1、Rab7分子的共定位消失及SIINFEKL-H2Kb復(fù)合物的減少，提示尼古丁對DCs交叉提呈的增強(qiáng)作用依賴于MR介導(dǎo)的內(nèi)吞抗原定位于內(nèi)體;以LPS活化TLR4信號不僅明顯增強(qiáng)TAP與EEA1、TAP與Rab7共定位，而且也顯著增強(qiáng)SIINFEKL與EEA1、SIINFEKL與MHCⅠ類分子及MHCⅠ類分子與EEA1的共

7、定位及SIINFEKL-H2Kb復(fù)合物的形成，與MHCⅠ類分子相反，MHCⅡ類分子與SIINFEKL、Rab7共定位并不受到LPS影響。當(dāng)以SiRNA轉(zhuǎn)染沉默MyD88表達(dá)時(shí)，不僅LPS誘導(dǎo)的TAP內(nèi)體轉(zhuǎn)位明顯降低，而且SIINFEKL與MHCⅠ類分子于內(nèi)體的共定位、SIINFEKL-H2Kb復(fù)合物的形成也明顯降低，提示尼古丁對DCs形成SIINFEKL-MHCⅠ類分子復(fù)合物的能力依賴于LPS誘導(dǎo)的MyD88介導(dǎo)的TAP內(nèi)體轉(zhuǎn)位;以人外