TLR4信號通路在大鼠慢性應(yīng)激心肌損傷中作用的研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　 應(yīng)激為機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會、心理因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)。軍事應(yīng)激是指軍人在完成軍事任務(wù)過程中對極端惡劣生存環(huán)境、精神超負(fù)荷緊張及超強(qiáng)度作業(yè)等在內(nèi)的多種因素反應(yīng)過程，包括心理、生理上的變化。適度應(yīng)激反應(yīng)往往能活化思維、提高軍人的警覺性和作業(yè)效率，但當(dāng)應(yīng)激壓力導(dǎo)致軍人的認(rèn)知、情緒和行為發(fā)生改變、嚴(yán)重降低作業(yè)效率時(shí)，則表現(xiàn)為軍事應(yīng)激障礙。
　　 心臟是應(yīng)激作用的主要靶器官之一

2、。研究發(fā)現(xiàn)多種心臟疾病的發(fā)生和發(fā)展與應(yīng)激機(jī)制的激活密切相關(guān)，神經(jīng)體液因素特別是炎癥細(xì)胞因子的釋放是重要機(jī)制。Toll 樣受體是一種膜受體，在機(jī)體防感染免疫中起關(guān)鍵作用，能被機(jī)體“危險(xiǎn)”信號如：應(yīng)激、損傷、壞死等激活。在心臟中主要表達(dá)TLR4。TLR4 激活使得信號轉(zhuǎn)導(dǎo)到胞內(nèi)，在一系列酶的作用下，NF-κB 活化，轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中誘導(dǎo)特定基因的表達(dá)，導(dǎo)致炎癥因子產(chǎn)生。
　　 TLR4/NF-κB通路在慢性應(yīng)激心臟中的作用還不清楚。為搞

3、清上述問題，本課題建立了大鼠慢性應(yīng)激模型，觀察慢性應(yīng)激對心肌的影響，研究TLR4/NF-κB、IL-6、TNF-α等和心肌損傷的關(guān)系，希望探索TLR4/NF-κB在慢性應(yīng)激心臟中的作用，為慢性應(yīng)激致心肌損傷防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 二、材料和方法：
　　 第一部分：軍事訓(xùn)練應(yīng)激對戰(zhàn)士心血管系統(tǒng)影響的觀察選取連隊(duì)健康男性戰(zhàn)士64人，年齡18-20歲，同時(shí)選取健康男戰(zhàn)士10名做對照。
　　 軍事訓(xùn)練應(yīng)激為3 公里越野

4、加5分鐘數(shù)學(xué)運(yùn)算，軍事訓(xùn)練前后檢測BP、HR、EKG和SCL-90量表，并于訓(xùn)練后抽血查血常規(guī)、C-RP、心肌酶譜、ACTH、皮質(zhì)醇、TNF-α、IL-6。對照組只抽血，不參加軍事訓(xùn)練。
　　 第二部分：大鼠慢性應(yīng)激致心肌損傷及NAC防治作用研究選用雄性SD大鼠，6-7周齡，體重180-220g，動物隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組又分為應(yīng)激1d、1w、2w、3w、4w、NAC組，每組8只。實(shí)驗(yàn)組采用每天束縛6h+強(qiáng)迫游泳15mi

5、n 應(yīng)激模式，NAC組在應(yīng)激同時(shí)每日給予NAC150mg/kg 灌胃，持續(xù)2周。實(shí)驗(yàn)期間每3天稱1次體重，每天觀察大鼠行為變化。
　　 各組于試驗(yàn)結(jié)束次日處死大鼠。處死前連續(xù)記錄5分鐘心率、EKG 變化，記錄血壓變化。分離血清，同時(shí)留取心尖部心肌標(biāo)本做TLR4 mRNA、NF-κB、電鏡、病理和心肌勻漿等檢查。對照組不應(yīng)激，和實(shí)驗(yàn)組大鼠同時(shí)處死取材。
　　 心肌酶CK 測定采用ABC-ELISA 方法，LDH、AST 用

6、全自動生化分析儀自動檢測。
　　 HE 染色觀察病理形態(tài)變化，同時(shí)根據(jù)心肌出血、水腫和滲出情況對心肌損傷進(jìn)行評分，透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)變化。采用Tunel 法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，用免疫組化方法觀察心肌組織iNOS表達(dá)。
　　 第三部分：TLR4信號通路在慢性應(yīng)激大鼠心肌表達(dá)和意義的研究實(shí)驗(yàn)動物及分組同第二部分。用RT-PCR方法測定心肌TLR4mRNA表達(dá)，用EMSA方法測定心肌NF-κB活性，用ELISA方法測定

7、心肌勻漿TNF-α、IL-6含量，用免疫組化方法觀察心肌組織TNF-α、IL-6表達(dá)。
　　 統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，樣本均數(shù)比較用t 檢驗(yàn)，組間比較用單因素方差分析，P＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 三、結(jié)論
　　 1、軍事訓(xùn)練急性應(yīng)激后戰(zhàn)士出現(xiàn)了心率增快、舒張壓升高等表現(xiàn)，C-RP 升高，部分戰(zhàn)士EKG 出現(xiàn)了竇性心動過速、頻發(fā)房性早搏、ST 段抬高等表現(xiàn)。說明軍事訓(xùn)練后可

8、以出現(xiàn)心血管方面的改變。
　　 2、成功建立了大鼠“束縛+強(qiáng)迫游泳”慢性應(yīng)激模型。應(yīng)激大鼠皮質(zhì)酮含量從應(yīng)激后2周開始升高，出現(xiàn)了明顯的焦慮、倦怠、反應(yīng)低下、食欲減少、體重增長減慢等變化。
　　 3、慢性應(yīng)激大鼠血漿心肌酶升高，心肌病理和超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了改變，心肌細(xì)胞凋亡增加，部分大鼠出現(xiàn)了室上性心動過速、室性早博、房顫等心律失常表現(xiàn)，表明慢性應(yīng)激可導(dǎo)致大鼠心肌損傷。
　　 4、慢性應(yīng)激大鼠心肌TLR4表達(dá)增高，NF